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Biochemistry

Real-tempo, semi-automatizado de medição fluorescente do pH líquido de superfície das vias aéreas das células epiteliais das vias aéreas humanas primárias

Published: June 13, 2019
doi:
10.3791/59815
, , , , , ,
1Epithelial Research Group, Institute for Cell and Molecular Biosciences, Faculty of Medical Sciences,Newcastle University, 2Respiratory Group, Institute of Cellular Medicine, Faculty of Medical Sciences,Newcastle University, 3Paediatric Respiratory Medicine, Great North Children’s Hospital,Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust, 4Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co

Summary

Nós apresentamos um protocolo para fazer medidas dinâmicas do pH líquido da superfície da via aérea circunstâncias finas da película usando um Plate-Reader.

Abstract

Nos últimos anos, a importância do pH superficial da mucosa nas vias aéreas tem sido destacada pela sua capacidade de regular a hidratação do líquido de superfície das vias aéreas (ASL), a viscosidade do muco e a atividade dos peptídeos antimicrobianos, parâmetros-chave envolvidos na defesa inata da Pulmões. Isso é de relevância primordial no campo das doenças respiratórias crônicas, como a fibrose cística (FC), onde esses parâmetros são desregulados. Enquanto diferentes grupos estudaram o pH da ASL tanto in vivo como in vitro, seus métodos relatam uma gama relativamente ampla de valores de pH da ASL e até mesmo achados contraditórios em relação a quaisquer diferenças de pH entre as células não CF e CF. Além disso, seus protocolos nem sempre fornecem detalhes suficientes para garantir a reprodutibilidade, a maioria são de baixa taxa de transferência e exigem equipamentos caros ou conhecimentos especializados para implementar, tornando-os difíceis de estabelecer na maioria dos laboratórios. Aqui nós descrevemos um ensaio fluorescente semiautomatizado do leitor da placa que permita a medida do tempo real do pH de ASL as condições finas da película que se assemelham mais pròxima à situação in vivo. Esta técnica permite medições estáveis por muitas horas a partir de múltiplas culturas de vias aéreas simultaneamente e, mais importante, mudanças dinâmicas no pH da ASL em resposta a agonistas e inibidores podem ser monitorados. Para conseguir isto, o ASL de pilhas epithelial humanas preliminares inteiramente diferenciadas da via aérea (hAECs) é manchado durante a noite com um corante pH-sensível a fim permitir a reabsorção do líquido adicional para assegurar condições finas da película. Após a monitorização da fluorescência na presença ou ausência de agonistas, a calibração do pH é realizada in situ para corrigir o volume e a concentração de corante. O método descrito fornece os controles necessários para fazer medições de pH de ASL estáveis e reprodutíveis, o que, em última análise, poderia ser usado como uma plataforma de descoberta de drogas para a medicina personalizada, bem como adaptado a outros tecidos epiteliais e experimentais tais como modelos inflamatórios e/ou patógenos do hospedeiro.

Introduction

O epitélio das vias aéreas é coberto por uma fina camada de fluido (~ 10 μm) denominada líquido de superfície das vias aéreas (ASL). A composição e a profundidade (hidratação) desta ASL são fortemente reguladas e controla a eficiência da depuração das vias aéreas pela escada rolante mucociliar1,2,3,4. Nos últimos anos, a importância da ASL H+/HCO3– conteúdo tem sido demonstrado por diferentes grupos, devido à sua capacidade de regular a hidratação ASL5, inflamação das vias respiratórias6 e infecção7, 8 ,bem como a viscosidade do muco8,9. Importante, embora existam algumas controvérsias, muitos estudos relataram desregulação do pH das vias aéreas em doenças crônicas das vias aéreas, como asma10,11,12, DPOC11, bronquiectasis11, rinossinusite crônica13,14 e fibrose cística (CF)5,9,15,16,17, que sugere que as terapias que restauram o pH de ASL poderiam ser úteis tratar tipos múltiplos de doenças crônicas da via aérea. A FC é a doença genética autossômica recessiva mais comum em populações caucasianos e é devida a mutações no gene do regulador de condutância transmembrana CF (CFTR). Este gene codifica um ânion (HCO3– e CL–) canal que desempenha um papel crucial no transporte de íons e fluidos e homeostase através de epitélios18. Embora a FC seja uma doença multiorgânica, a patologia pulmonar é a principal causa de morbidade e mortalidade19,20 e Considerando que o defeito primário na FC é um transporte prejudicado de CL– e HCO3–, pode-se supor que o pH do fluido extracelular em pessoas com FC será disregulado em comparação com pessoas que não têm FC. assim, a mensuração do pH da ASL tem sido uma área tópica de pesquisa de FC e diferentes grupos desenvolveram técnicas para medir o pH da ASL na FC Airways.

In vivo, o pH das vias aéreas tem sido medido utilizando diferentes técnicas, de microsondas (sondas de fibra óptica, ouro ou mobidium)5,21,22,23,24 a medições de pH de material expectorado ou condensado exalado da respiração (EBC)10,11,12,25,26,27. No campo de pesquisa da FC, o pH está sendo amplamente estudado devido às suas potenciais implicações clínicas. Teoricamente, tornar as vias aéreas mais alcalinas poderia aumentar a matança bacteriana e melhorar a depuração mucociliar e a homeostase das vias aéreas como um todo. No entanto, estudos in vivo/ex vivo relatam uma ampla gama de valores de pH, e até o momento, os resultados não são conclusivos quanto à existência de uma diferença de pH entre as vias aéreas não CF e FC. No início dos anos 2000, diferentes grupos relataram o pH da EBC. Em grupos não-doentes, os valores de pH variaram de 4,6 a 8,5, mas curiosamente, o pH do EBC foi encontrado mais ácido durante as exacerbações em pessoas com CF12,13. Mais recentemente, as medições in vivo da ASL em modelos humanos e animais de FC relataram resultados conflitantes16,17,21,22,23, 24 e ainda não está claro se as vias aéreas CF são mais ácidas do que as vias aéreas não-cf.

Como a medida in vivo do pH inferior da ASL provou ser difícil devido à pequena quantidade de fluido que reveste as vias aéreas e a presença potencial de tampões de muco na doença, muitos grupos voltaram-se para experimentos in vitro para medir o pH da ASL, principalmente usando três diferentes Metodologias. A primeira abordagem usa Dextran-acoplado células-impersignificadas corantes fluorescentes pH-sensíveis que são adicionados como um pó seco, quer diretamente para a ASL ou usando um fluido inerte chamado perfluorocarbono (PFC)5,8,10 , 17 anos de , 28 anos de , 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32. no entanto, esta técnica fornece pouco controle sobre a quantidade exata de corante que é adicionado às culturas e apresenta um risco de agregados de corante e grandes diferenças na concentração entre amostras e/ou experimentos e até mesmo dentro da mesma amostra . Também geralmente tem sido realizada com um microscópio confocal, que limita a sua aplicabilidade e, em muitos casos, impede a monitorização detalhada de múltiplas amostras e alterações nas condições de gravação. O segundo método empregado para mensurar o pH da ASL é o uso de microeletrodos sensíveis ao pH5,15. As medições de pH da ASL não dependem, portanto, da concentração de corante fluorescente e devem dar resultados mais robustos e reprodutíveis. No entanto, este método não permite medições dinâmicas em tempo real do pH da ASL, nem é fácil fazer várias leituras em diferentes condições. É também um processo trabalhoso, complexo, que requer equipamentos especializados (fabricação de microeletrodos/dispositivos de gravação eletrofisiológica) e treinamento para coleta das amostras para posterior medição e calibração de pH. Além disso, essas duas técnicas também mostraram algumas inconsistências na capacidade de produzir resultados reprodutíveis: usando o método de corante fluorescente sensível ao pH, Tang et al. relataram valores de 7,35 para não-CF ASL e 7,0 para CF ASL8 , enquanto em uma papel recente do mesmo grupo, o pH da ASL foi de 6,9 e 6,4 para não CF e FC, respectivamente17. De forma semelhante, as medições de microeletrodos deram valores de 6,4 em ASL não-CF e 6,1 na FC ASL em um estudo de 200315 enquanto o mesmo grupo relatou valores de 6,7 para não-CF asl e 6,45 para FC ASL em um estudo de 20135. Finalmente, na terceira abordagem, os pesquisadores adicionam um volume relativamente grande de solução fracamente tamponada na superfície apical (mucosa) das culturas, destruindo, assim, as condições da película fina e alterando a composição da ASL e, potencialmente, sua regulação. o pH é então medido usando corantes fluorescentes sensíveis ao pH33, por um método de titulação de pH-stat em uma câmara de Ussing13,14, ou requer que a ASL diluída seja removida das culturas e pH medido usando um pH eletrodo, analisador ou Litmus tiras34. Outra dificuldade na medição exata do pH da ASL é o estabelecimento de uma curva padrão que é tão precisa quanto possível. Na verdade, se as leituras são realizadas com um eletrodo que irá medir a diferença no potencial elétrico através de uma resina ou usando corantes fluorescentes sensíveis ao pH, ambas as abordagens serão afetadas pelo microambiente local das amostras sendo Medido. Mais especificamente, a constante de dissociação (KD) dos corantes pode variar consideravelmente, dependendo da temperatura, força iónica, viscosidade, bem como potenciais interações do corante com constituintes celulares, tais como proteínas e potencialmente muco.

Para tentar superar muitas dessas questões técnicas, bem como desenvolver um método de produção mais dinâmico, mais simples e mais elevado, estabelecemos uma técnica in vitro que registra o pH da ASL em culturas primárias de hAEC usando uma célula-imperfeita de pH-sensível corante fluorescente em um leitor de placa comercial padrão. O método gera medições reprodutíveis, dinâmicas, semiautomatizadas e em tempo real do pH da ASL de culturas de células 3D totalmente diferenciadas em condições de filme fino. Com o uso de um leitor da placa do múltiplo-poço, este ensaio semiautomatizado pode fazer perto das medidas simultâneas do pH para até 24 circunstâncias sobre 12 h e pode monitorar o efeito de adicionar vários agonistas ou nervos inibidores. Neste trabalho descrevemos a metodologia em detalhe e relatamos resultados representativos condições de controle positivas e negativas que valide a técnica.

Protocol

Não-CF primário (n = 3 doadores, idade 34, 27 e 23 anos) e FC (n = 3 doadores, todos os F580del/F508del; idade 40, 41, desconhecido) haecs foram um presente amável do Dr. Scott H. Randell (Marsico Lung Institute, a Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill, Estados Unidos) e foram obtive Ned protocolo #03-1396 aprovado pela Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill Conselho de revisão institucional biomédica. As células foram cultivadas de acordo com os métodos previamente publicados, utilizando os meios de crescimento e diferenciação descritos por Fulcher e Randell35,36. 1. preparação da amostra Cresça haecs preliminar em apoios semi-permeáveis do diâmetro de 6,5 milímetros (tabela dos materiais) na relação ar-líquida por pelo menos 28 dias, como descrito previamente35,36. Prepare 50 ml de solução estéril de solução tampão de Krebs contendo HCO3 (HCO3- KRB, as concentrações são dadas em mm NaHCO3 (25) NaCl (115), KCl (5), CAcl2 (1), MgCl2 (1), D-glucose (5)) e esterilizar o filtro utilizando um filtro de seringa de 0,2 μm. Mude o meio basolateral ao meio de diferenciação fresco como descrito em 1,135,36.Nota: demonstrou-se que a concentração basolateral da glicose afeta o pH33de ASL. Nesta fase, o teor de glicose do compartimento basolateral pode ser controlado substituindo o meio por soluções tamponadas de concentrações conhecidas de glicose. Lave a superfície apical das células adicionando 150 μL de HCO3- KRB e incubato por 20 min a 37 ° c, 5% co2. Retire a lavagem apical sem interromper o epitélio aspirando-o com cuidado usando um Pipet de vidro estéril de Pasteur e uma ponta estéril do Pipet de P200 lig a uma bomba da aspiração que crie um vácuo no frasco da coleção. Nesta fase, deve haver tão pouco líquido restante na superfície apical como possível restaurar a relação do ar-líquido. Incubar as células por mais 30 min a 37 ° c, 5% CO2. 2. medição de fundo Ligue o leitor de placas e o computador. Abra o Dashboard. Estale sobre a faísca 10m, abra o controle de temperatura e ajuste-o a 37 ° c. Abra o controle de gás e ajuste o CO2 a 5%. Espere até que a temperatura e o CO2 alcangaram seus alvos. Abra a gaveta do leitor de chapa, insira o cartucho de humidade preenchido com 6 mL de dH2o em cada lado. Certifique-se de que a tampa e a parte inferior da placa estão limpas – se não, limpe com 70% do etanol sobre um pedaço de tecido – e coloque a placa na gaveta de humidade.Nota: durante todo o experimento, a tampa da placa da cultura do tecido é mantida na placa e removida somente ao adicionar drogas ou ao mudar o meio basolateral, que são executados em uma capa laminar do fluxo da cultura do tecido para manter as culturas em um ambiente estéril. Abra o editor de método do Spark e configure os parâmetros no software da seguinte maneira: Selecione o modelo de placa apropriado (para suportes semi-permeáveis de 6,5 mm de diâmetro, selecione a placa de 24 poços) e as cavidades que serão monitoradas durante este experimento. Adicione um painel de controle da temperatura e do CO2 e ajuste-os a 37 ° c e a 5%, respectivamente. Marque a espera para caixas de temperatura/gás . Adicione um painel de loop cinético e selecione a duração como o tipo de loop e defina-o como 5-10 min. escolha não definido como o tipo de intervalo para habilitar a leitura contínua.Nota: o tempo de leitura contínua depende do número de poços/condições. 5 min é longo o suficiente para 6-12 poços, enquanto uma placa cheia contendo 24 condições exigirá 10 min de medições contínuas. Dentro da alça cinética, adicione dois painéis de “intensidade de fluorescência”, usando a função de arrastar e soltar, que será configurado para o pH-sensível e os corantes fluorescentes de pH insensível, respectivamente. Ajuste comprimentos de onda da excitação e da emissão a 560 e a 590 nanômetro, respectivamente, para o corante pH-sensível e 495 e 520 nanômetro, respectivamente, para o corante pH-insensível. Defina o número de flashes para 30 e a posição z para 33200 para cada fluoróforo.Nota: a posição z e as definições de ganho dependem das características do leitor de placas. Defina o ganho manualmente para um valor que dará contagens altas o suficiente para que as diferenças entre as amostras serão colhidas, mas baixo o suficiente para que a adição de um agonista não irá gerar valores fora do intervalo de detecção. Defina a leitura múltipla por poço para o usuário definido como um tipo de círculo de 3 × 3 tamanho com uma borda de 4750 μm. Clique no botão Iniciar para fazer uma medição de fundo e OK para confirmar a tampa da gaveta de umidade está no lugar. Na extremidade da medida, abra a gaveta do leitor da placa, tome a placa para fora e pplace o célulasela para trás na incubadora ao preparar a solução fluorescente da mistura da tintura. Prepare a solução de mistura de corante fluorescente adicionando 2 μL de corante fluorescente sensível ao pH (phsens) com 1 mg/ml de Dextran a 0,2 μL de corante fluorescente de 10 mg/ml de pH (Phins) acoplado a Dextran e 0,8 μL de HCO3- KRB estéril para um final volume de 3 μL por condição.Nota: o volume total da solução de mistura de corante deve ser preparado para n poços + 1 se existirem entre 1 e 10 amostras, ou n poços + 2 se existirem entre 11 e 24 amostras. Os corantes acoplados à Dextran são reconstituídos em solução de HCO3- KRB filtrada-estéril, aliquotada e armazenada a-20 ° c. Qualquer produto químico pode ser adicionado nesta fase por um período de incubação de 16-24 h37 na superfície apical. Os produtos químicos devem ser preparados como 0.1 x, como o volume final, após a absorção do excesso de fluido pela cultura, será de cerca de 0,3 μL para um suporte semipermeável de 6,5 mm de diâmetro. Adicione com cuidado 3 μL da mistura da tintura (Veja 2,8) à superfície apical das pilhas e incubar durante a noite em 37 ° c, 5% CO2. 3. cinética de medição Repita os passos 2,1 a 2,4 para preparar o leitor de chapa. Clique no ícone abrir e selecione o arquivo de método usado para as medições de plano de fundo No painel de loop cinético, mantenha o tipo de loop como duração e defina-o como 08 horas. Altere o tipo de intervalo para fixo e defini-lo para 5 minutos. Mantenha os painéis da intensidade da fluorescência o mesmos que para as medidas do fundoNota: o tipo de intervalo para medições em segundo plano é definido como “não definido” para permitir a leitura contínua. Para experimentos de cinética e de calibração, o tipo de intervalo é definido como “fixo” com um intervalo de 5 min. Isto pode ser ajustado de acordo com o projeto do experimento e o número de condições. Abra a gaveta do leitor da placa; Insira a gaveta de humidade preenchida com 6 mL de dH2O em cada lado. Certifique-se de que a tampa e a parte inferior da placa estão limpas – se não, limpe com 70% de etanol sobre um pedaço de tecido – e coloque a placa na gaveta de humidade, com a sua tampa. Inicie as leituras de fluorescência clicando em Iniciar. Clique em OK depois de garantir que a tampa da gaveta de humidade está no lugar. Após ciclos de n, geralmente entre 12 e 24, que equivale a 1 a 2 horas, clique em Pausar para interromper o experimento. Tome a placa para fora e aplique todas as drogas/agonists basolaterally às amostras diferentes.Nota: quando as células são retiradas do leitor de placas, o CO2 escapa e isso induz um aumento no pH da ASL, como mostrado por uma gota na fluorescência de corante sensível ao pH. Esta mudança de pH induzida pelo CO2reverte dentro de 10-15 min depois de colocar as culturas de volta no leitor de placas. Põr a placa para trás na gaveta da umidade na bandeja, reposicione a tampa da gaveta da umidade e o clique continua a fim gravar mais o pH de ASL e monitorar o efeito dos fármacos/Agonists no pH de ASL. 4. calibração de pH in situ Tire a placa do leitor de placas. Aspirar o meio/solução basolateral. Adicione 750 μL e 1 μL de soluções de curva padrão altamente tamponada ao compartimento basolateral e à superfície apical, respectivamente.Nota: as soluções de curva padrão altamente tamponadas contêm (em mM) NaCl (86), KCl (5), CaCl2 (1,2), MgCl2 (1,2), NAHEPES ou MES ou tris (100 mm). Utilize o MES para soluções tampão com um pH inferior a 7, NaHEPES para soluções de pH 7-7,5 e Tris para solução com pH 8. Aperte o pH para o valor desejado usando HCl. Desligue o CO2 no leitor de chapa ou ajuste-o para 0,1% e coloque a placa de volta na gaveta de humidade. Configure o leitor de placas com os mesmos parâmetros descritos anteriormente, mas sem CO2 como na etapa 3,2. Iniciar leituras de fluorescência, a cada 5 min para 1-1,5 h. 5. avaliação do efeito da concentração de corante e do volume de suspensão nos dados de calibração Prepare o suficiente mistura de corante sensível ao pH e insensível para gravar a fluorescência em um mínimo de 4 valores de pH diferentes em 3 volumes diferentes.Nota: aqui, a mistura 1 foi preparada com 26 μL de pH-sensível (1 mg/mL) e 2,6 μL de pH-insensível (10 mg/mL) e mistura 2 com 13 μL de pH-sensível (1 mg/mL) e 1,3 μL de pH-insensível (10 mg/mL). Distribuir 2,2 μL ou 1,1 μL de mistura 1 ou misturar 2, respetivamente, em 12 poços de uma placa de 96 poços e acrescentar soluções de calibração suficientes para obter volumes finais de 50, 100 ou 200 μL e misturar bem.Nota: neste conjunto, serão registadas contagens de fluorescência para concentrações de corantes de 5 μg/mL (em 200 μL), 10 μg/mL (em 100 ou 200 μL), 20 μg/mL (em 50 ou 100 μL) ou 40 μg/mL (em 50 μL). Gire o leitor da placa sobre, ajuste a temperatura a 37 ° c e introduza a placa no leitor da placa. Não ligue o controlador CO2 .Nota: como este é um experimento curto e só requer tempo suficiente para equilibrar a temperatura, a gaveta de umidade não é necessária. Ajuste a posição z e ganhe para a placa 96 bem e use os mesmos parâmetros que para o experimento feito em suportes semipermeáveis. 6. análise de dados Salve todos os dados em planilhas e crie um novo arquivo. No arquivo de plano de fundo, selecione todos os dados médios para cada amostra/condição para ambos os comprimentos de onda, copiar e colar para o novo arquivo. Calcule o fundo médio para cada poço e cada comprimento de onda. Repita isso com os dados de calibração e cinética e subtraia o plano de fundo de cada ponto de dados para cada comprimento de onda. Para cada ponto de tempo e cada amostra, calcule a relação entre fluorescência pH-sensível e pH-insensível Se todas as amostras foram obtidas de um doador individual, calcular a média das proporções em cada ponto de tempo da curva de calibraçãoNota: é importante gerar tantas curvas de calibração como doadores ou soluções basolateral. Na verdade, esses parâmetros podem afetar as leituras de fundo ou a taxa de absorção do fluido, que por sua vez afetará a concentração de corante e, portanto, o pH calculado. Para cada ponto de tempo, gere uma curva padrão a partir das proporções, traçando os valores de pH conhecidos no eixo x e as proporções no eixo y. Determine o ponto de tempo em que as proporções são estáveis, ajuste uma linha de regressão linear e obtenha a equação para esta linha. A partir dos dados cinéticos, calcule o pH para cada ponto de tempo e plotar o pH no eixo y e o tempo no eixo xNota: o pH de repouso/basal pode ser calculado através da média de pontos de dados sobre a medição estável do pH antes da adição de qualquer agonista ou qualquer outra intervenção. O efeito de um agonista pode ser caracterizado pelo cálculo da diferença de pH antes e depois (uma certa quantidade de tempo) o tratamento ou pela montagem de uma curva não-linear para os pontos de dados diretamente após a intervenção. Isso dará informações adicionais sobre o t1/2 e o valor máximo. Finalmente, as taxas de acidificação ou alcalinização também podem ser obtidas a partir da inclinação de uma linha reta ajustada aos primeiros pontos após a intervenção.

Representative Results

A técnica descrita acima permite a medida dinâmica do pH de ASL em até 24 culturas preliminares separadas de hAECs. A Figura 1 mostra um esquema das etapas principais e do equipamento configurado. As células durante a noite são colocadas em um CO2 e temperatura controlada leitor de placas em que a fluorescência de Dextran-acoplado pH-sensível e pH-insensível corantes são gravados a cada 5 min. Figura 1: esquema do método de medição do pH da ASL. Após a lavagem das culturas e a realização de uma leitura de fundo, as células epiteliais das vias aéreas humanas primárias (hAECs) ASL são carregadas com mistura de corante pH-sensível e pH-insensível acoplada durante a noite a 37 ° c, 5% CO2. No dia seguinte, a placa é transferida para uma temperatura e leitor de placa controlada CO2e fluorescência de ambos os corantes é gravado ao longo do tempo. Após o experimento, uma calibração in situ é realizada e os dados analisados e apresentados como pH da ASL ao longo do tempo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Em primeiro lugar, investigamos o efeito de diferentes volumes e concentrações de corante nas contagens de fluorescência e, portanto, na relação 560/495. De fato, a finalidade de adicionar o pH-insensível ao corante pH-sensível é corrigir para a variabilidade no carregamento de ASL. No entanto, foi importante testar essa suposição e avaliar se poderíamos usar uma curva de calibração padrão realizada na ausência de células em uma placa de 96 poços para todos os experimentos e tipos de células. Nós monitoramos contagens de fluorescência mais de 1 h em 50, 100 ou 200 μL de soluções de calibração (em pH 5,5, 6,5, 7 ou 8) contendo 5, 10, 20 ou 40 μg/mL de corantes. Os resultados são apresentados na Figura 2a-C, e mostram que para o mesmo pH e a mesma concentração de corantes, a razão de emissão de phsens/Phins relatada (560/495 no eixo y) diferiu dependendo do volume (Figura 2a). Adicionalmente, com o mesmo pH e mesmo volume, diferentes concentrações de corante proporcionam valores de proporções diferentes (Figura 2b). Portanto, as alterações no volume ou na concentração de corante afetarão o valor absoluto do pH calculado a partir da razão de emissão. A Figura 2C mostra que o tempo necessário para a equilibração da temperatura é aproximadamente 15-20 min. Para confirmar o efeito da concentração de corante e do volume sobre as razões de emissão, registramos fluorescência de corantes carregados na ASL de não-CF e CF hAECs in situ. Em seguida, realizamos a calibração e analisamos os resultados por (1) gerando uma curva padrão global de todas as amostras ou (2) gerando duas curvas padrão independentes para cada tipo de célula (não CF e FC). O pH da ASL de ambos os tipos de células foi então plotado contra o tempo (Figura 3a, B) e a média (Figura 3C). Os valores de pH da ASL obtidos a partir de uma única curva padrão global mostraram uma diferença significativa entre as culturas não CF e FC (Figura 3a, C) Considerando que o pH da ASL não foi significativamente diferente entre a FC e as haecs não CF quando o pH foi calculado a partir de curvas padrão independentes (Figura 3B, C). Esses resultados mostram a importância de se gerar curvas de calibração independentes para cada experimento e dentro do experimento, para cada amostra de doador, uma vez que quando as curvas de calibração foram médias em conjunto, maiores valores de razão pHsens/pHins foram encontrados em culturas de FC , indicando um pH mais ácido (Figura 3C). Figura 2: otimização da calibração de pH in vitro. Os volumes diferentes de soluções do pH conhecido e que contêm concentrações diferentes da tintura foram carregados em uma placa do poço 96 e a fluorescência foi gravada sobre 1 h. efeito do volume (a) e da concentração da tintura (B) em relações da fluorescência. As razões foram plotadas de encontro ao pH para o tempo-ponto 24 min. (C) a inclinação da mudança na fluorescência foi calculada para cada solução e plotada em função do tempo (no minuto). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: otimização da análise da calibração de pH em hAECs primário in situ. (A) traços representativos de pH da ASL obtidos a partir de uma curva padrão única, com média de dados de culturas não CF e cf. (B) traços representativos de pH da ASL obtidos a partir de uma curva padrão independente realizada em culturas não CF ou cf. Cada conjunto de dados foi calculado a partir de sua própria curva de calibração. (C) avaliação das diferenças no pH da ASL entre culturas não CF e CF em função de como a calibração foi realizada. Os dados representam a média ± SEM de n = 3 experimentos, ANOVA de 2 vias, teste de comparações múltiplas de Sidak). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A fim de validar ainda mais nossa técnica, exigimos um controle positivo para demonstrar que a técnica foi capaz de detectar uma mudança ‘ esperada ‘ no pH da ASL. Como a presença de uma ASL mais ácida nas células CF ainda é controversa, utilizou- se a forskolina agonista do acampamento, como condição de controle positivo, para estimular a secreção de HCO3através do CFTR. Os resultados esperados mostrariam uma alcalinização forskolina induzida pela ASL em células não-CF que seriam largamente diminuídas ou abolidas nas células CF, dependendo da gravidade das mutações. A figura 4a mostra traços representativos de pH da ASL de células não CF e CF ao longo do tempo e a Figura 4B mostra os dados médios do pH da ASL antes e após o tratamento com forskolin em ambos os tipos de células. Podemos obter informações diferentes desses resultados. Em primeiro lugar, como já demonstrado na Figura 3B, C, o pH da ASL em repouso não foi diferente entre os epithelia não CF e cf. Em segundo lugar, os primeiros 3-4 pontos de tempo depois de pausar o experimento para tratar as células com forskolin, mostraram um grande aumento no pH que se recuperou dentro de ~ 15 min. Isso se deve à queda da concentração de CO2 entre o leitor de placas (5%) e o armário de segurança da cultura do tecido (~ 0%). De acordo com a equação de Henderson Hasselbalch, um pH de 7 em um ambiente de 5% co2 equivale a uma concentração de HCO3- de ~ 9,3 mm. Quando as células são removidas do leitor de placas, uma queda na concentração de CO2 para 0%, teoricamente, levará a um aumento do pH de > 8. A figura 4a mostra que o pH da ASL aumentou para ~ 7,8, o que pode ser explicado pelo lapso de tempo Reposicionando a placa no leitor de placas (ou seja, em um ambiente de 5% co2 ). Finalmente, como previsto, a adição de 10 μM de forskolina basolateral (FSK) aumentou significativamente o pH da ASL em culturas não-CF apenas. Como tem sido demonstrado por diferentes grupos que existe uma diferença no pH da ASL de estado estacionário entre CF e epithelia não-CF, queríamos investigar ainda mais a aparente ausência de uma diferença de pH em nossos experimentos e o papel do CFTR. Para isso, foram pré-incubadas culturas não-CF com o inibidor específico do CFTR, CFTRinh172 (172). Conforme indicado na seção de protocolo 2,8, a mistura corante foi preparada como mencionado acima e o inibidor foi adicionado em uma concentração de 0,1 X = 2 μM. De acordo com a literatura, a altura da ASL de células não-CF é de aproximadamente 10 μm. Em um suporte semipermeável de 6,5 mm de diâmetro, o volume teórico da ASL é, portanto, π × 3,252 = 0,3 μl. Ao adicionar 3 μL de corante + 172 a 2 μM, a concentração do inibidor, após a absorção do excesso de fluido, teoricamente será de 20 μM (1x, concentração desejada). Traços representativos na Figura 4C e Resumo médio na figura 4d mostram que 172 não reduziram o pH da ASL em repouso, mas impediam o aumento induzido pela forskolina no pH da ASL, confirmando assim nossos resultados obtidos de não-CF versus CF outras culturas e validando nossa técnica. Figura 4: medida dinâmica do pH de ASL em resposta à ativação de CFTR pela forskolina. (A) traços representativos do efeito da forskolina (FSK, 10 μm) sobre a cinética do pH da ASL ao longo do tempo em haecs não CF e FC. Os dados representam a média ± SEM de n = 3 experimentos. (B) síntese do efeito da FSK no pH da ASL em culturas não CF e cf. Os dados representam a média ± DP de n = 69 culturas não-CF e 35 culturas de FC (ANOVA de 2 vias, teste de comparações múltiplas de Sidak). (C) traços representativos do efeito da CFTRinh172 (172, 20 μm) sobre o aumento induzido pelo FSK no pH da ASL em haecs não cf. Os dados representam a média ± SEM de n = 5 experimentos. (D) síntese do efeito de 172 na alcalinização induzida pela FSK da ASL em culturas não-cf. Os dados representam a média ± SEM de n = 5 experimentos (ANOVA de 2 vias, teste de comparações múltiplas de Sidak). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Finalmente, como indicado na seção de protocolo 6,8, as taxas de acidificação/alcalinização podem ser calculadas ajustando uma regressão linear aos tempos-pontos iniciais após a intervenção. A Figura 5a mostra que a remoção da solução contendo HCO3 basolateral (HCO3- KRB) e substituindo-a por uma solução tamponada de HEPES, na ausência de co2, induziu uma acidificação acentuada da ASL. Isso é consistente com a falta de HCO3- inibição transepielial HCO3- secreção, que permite a secreção de prótons constitutivos por estas células das vias aéreas para reduzir firmemente o pH de ASL15, 17. Curiosamente, a taxa inicial de acidificação de células não-CF foi significativamente mais lenta do que as culturas de FC (Figura 5b). Figura 5: alterações dinâmicas no pH da ASL em resposta à remoção de HCO3 . (A) traços representativos mostrando o efeito da HCO3- remoção sobre a cinética do pH da ASL ao longo do tempo em não-CF e CF haecs. As taxas iniciais de acidificação foram obtidas através da inclinação de uma linha reta ajustada a 7 tempos-pontos após a remoção de HCO3 . Os dados representam as médias ± SEM de n = 6 e 7 experimentos em culturas não CF e CF, respectivamente. B) síntese das taxas iniciais de acidificação após a remoção da HCO3 . Os dados representam as médias ± SEM de n = 6 e 7 experimentos em culturas não CF e CF, respectivamente (teste de Mann-Whitney). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a medida dinâmica do pH de ASL em pilhas epithelial humanas preliminares da via aérea. As etapas críticas incluem a lavagem do muco fora da superfície apical das células, medindo e subtraindo o fundo usando os mesmos parâmetros que no experimento, otimizando a posição z e ganho e realizando uma calibração de pH in situ.

O primeiro passo de lavar as células é crucial, pois uma espessa camada de muco pode (i) impedir que os corantes alcançam a camada periciliar (PCL) e (II) atrasem ou impeçam a detecção de alterações na fluorescência em resposta a agonistas/inibidores. Nosso método foi desenvolvido para estudar como os haecs primários modularam a atividade dos transportadores HCO3– e H+ em resposta aos agonistas. Embora seja interessante investigar como as alterações no pH PCL se relacionam com as alterações no pH do muco, é necessário um desenvolvimento adicional deste protocolo, incluindo o uso de diferentes pesos moleculares-dextrans para segmentar diferencialmente as 2 camadas e z-scans através do ASL inteira.

A medida do fundo é uma outra etapa importante deste protocolo. A superfície apical do epitélios preliminar inteiramente diferenciado da via aérea é raramente completamente lisa que afetará o trajeto claro e conseqüentemente o fundo. Garantir que as leituras de fundo sejam realizadas nos mesmos pontos locais dos poços, pois durante o experimento é fundamental para a reprodutibilidade e estabilidade das gravações.

Otimizando a z-posição e ganho são passos necessários que precisam ser configurados para cada concentração diferente de corante fluorescente que será usado. Isso impedirá a alta variabilidade entre experimentos. Uma vez que ajustado acima, nosso ensaio fornece resultados estáveis e reprodutíveis. Uma das razões para isso é que os corantes são adicionados na superfície apical nas células em um pequeno volume de fluido que é facilmente reabsorvido pelo epitélio, deixando uma ASL homogênea rotulada. Outro método para manchar o ASL, que pode ser igualmente bem sucedido, pó seco usado ou uma “suspensão” em PFC. embora isso possa ser economia de tempo (como os experimentos são geralmente realizados dentro de 2 h), é improvável que os corantes secos totalmente solubilizar na ASL e, portanto, pode formar grupos. Assim, diferentes concentrações de corante sensível ao pH serão encontradas sobre a superfície das células epiteliais.

A calibração in situ do pH é uma etapa importante a fim obter resultados exatos, reprodutíveis. Como mostrado e explicado na seção de resultados, as diferenças nos volumes de ASL afetarão as contagens de fluorescência e, portanto, os valores de pH interpolados (Figura 2 e Figura 3). Embora diferentes grupos tenham publicado previamente medições de pH de ASL, uma ampla gama de valores tem sido obtida mesmo entre diferentes estudos publicados pelo mesmo grupo8,17. Acreditamos que realizando calibrações in situ, os resultados se tornarão mais reprodutíveis. Comparado a outras técnicas da calibração do pH, que usam o método elevado de K+/nigericin (ou de ionophores múltiplos) para gerar a curva padrão28,29,30, o ensaio apresentado aqui tem a vantagem que , contanto que cada etapa seja executada em um armário de segurança, as pilhas usadas para o pH de ASL podem ser lavadas, mantidas e reúso para outras experiências contanto que os tratamentos executados não afetem irreversivelmente as pilhas epithelial.

O desenvolvimento e a optimização deste ensaio forneceram resultados reprodutíveis e acreditamos que este método irá ajudar outros grupos com a sua medida de pH ASL. No entanto, essa técnica também tem algumas limitações devido a configurar e o tipo de células que estão sendo usadas. Monitorando o pH do ASL durante um período de tempo mais longo do que aquele apresentado aqui (> 8-10 h) pôde provar difícil porque um ambiente de alta umidade a longo prazo pôde danificar o equipamento e o fato que a maioria de leitores da placa oferecem somente a opção para gravar leituras cinéticas sobre um determinada quantidade de tempo (tipicamente 24 h). O uso de haecs primários totalmente diferenciados é crucial na forma como diferentes estágios de diferenciação afetarão a expressão dos transportadores HCO3– e H+ . No entanto, não há virtualmente nenhuma possibilidade de controlar com precisão o volume de ASL em células cultivadas condições de filme fino. Conforme indicado nas secções de protocolo e resultados, as alterações de volume afetarão a razão de fluorescência e, infelizmente, é necessário supor que nas células cultivadas a partir de um único indivíduo, semeadas no mesmo dia em diferentes suportes semipermeáveis, os volumes ASL será o mesmo. Decorrente desta limitação, qualquer agonista ou inibidor que afetará a secreção ou absorção de fluidos afetará o volume de ASL e, presumivelmente, as razões de fluorescência. No entanto, em nosso ensaio, a curva de calibração é realizada no final do experimento, para que possamos presumir que essas mudanças de volume afetarão as proporções de calibração da mesma forma que durante o experimento cinético. Por esta razão, aconselhamos grupos que estariam interessados em desenvolver este ensaio, para usar pelo menos 2-3 repetições por condição testada, pois isso permitirá o estabelecimento de uma curva padrão para cada condição.

Aqui nós apresentamos um ensaio simples, semiautomatizado, que permita a medida em tempo real do pH da superfície Mucosal condições da fino-película. Tem a capacidade de investigar respostas dinâmicas do pH em muitas culturas em uma maneira próximo-simultânea que permita comparações inter e intra-doador. Upscaling este método a um formato da placa do poço 96 usando o sistema polarizado (placas do poço de HTS 96)38 forneceria mesmo uma taxa de transferência mais elevada como um ensaio da descoberta da droga. Além disso, mostramos como essa técnica pode ser usada para estudar o efeito agudo dos agonistas no pH da ASL e já publicamos que esse método pode ser usado para estudar o efeito de longo prazo de um inibidor da bomba de prótons apical na CF hAECs ASL39. Como o pH demonstrou regular a infecção, inflamação, viscosidade do muco e transporte iônico, identificar alvos moleculares que podem aumentar o pH será valioso nos campos de pesquisa das doenças pulmonares crônicas e essa técnica irá potencialmente facilitar a desenvolvimento de triagem de medicamentos em abordagens de medicina personalizada. Finalmente, uma vez que a desregulação na homeostase ácido-base desempenha um papel importante em outras doenças, este protocolo pode ser adaptado, com etapas de otimização, a diferentes equipamentos (leitores de placas) e tipos de células, como outras células epiteliais. A acidez extracelular é uma característica do câncer40,41,42 e este ensaio pode ajudar a determinar como os tumores sólidos produzem baixo pHe ou podem ser usados como um ensaio de triagem de drogas de baixa taxa de transferência para restauração da homeostase do pH. Similarmente, como para doenças crônicas da via aérea, poderia igualmente fornecer uma plataforma para o desenvolvimento de uma aproximação personalizada da medicina.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por dois subsídios do centro de investigação estratégica da CF Trust (SRC003 e SRC013) e um Conselho de investigação médica (MRC) confiança no conceito de subvenção (MC_PC_15030). JG foi apoiado por uma subvenção da Fundação de investigação médica (MRF-091-0001-RG-GARNE). MB foi apoiado por um médico do Conselho de pesquisa clínica cientista Fellowship (MR/M008797/1). IH foi apoiado por uma bolsa de treinamento clínico Wellcome Trust (203520/Z/16/Z). A pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de pesquisa em saúde Newcastle biomédico centro de pesquisa baseado em Newcastle Hospitals NHS Fundação Trust e Newcastle University. Os pontos de vista expressos são os do (s) autor (es) e não necessariamente os do NHS, o NIHR ou o departamento de saúde. As células primárias do Dr. Randell foram apoiadas pela subvenção da Fundação de fibrose cística (BOUCHE15R0) e pela concessão de NIH (P30DK065988).

Materials

0.2 µm syringe filter Starlab E4780-1226
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3470
CaCl2 Sigma Aldrich 21115
CFTRInh172 RnD Systems (Tocris) 3430 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran ThermoFisher D22910 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran ThermoFisher P10361 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Forskolin RnD Systems (Tocris) 1099 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM
Greiner CELLSTAR 96 well plates Cellstar 655180
Humidity cassette TECAN 30090495
KCl Sigma Aldrich P9541
MES Sigma Aldrich M3885
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
NaCl Sigma Aldrich S9888
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NaHepes Sigma Aldrich H3784
Plate reader: TECAN SPARK 10M TECAN 30086375
Tris Sigma Aldrich T1503
Universal pH electrodes DJ 113 VWR 662-1385
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Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, A. I., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M., Gray, M. A. Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (148), e59815, doi:10.3791/59815 (2019).
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