في الوقت الحقيقي ، وشبه التلقائي قياس الفلورسنت من الدرجة الهوائية السائل سطح المجري الجوي للخلايا الاساسيه الإنسان الظهاريه
Summary
نقدم بروتوكولا لاجراء قياسات ديناميكية لدرجه الحموضة السائلة السطحية لمجري الهواء تحت ظروف الأفلام الرقيقة باستخدام قارئ اللوحة.
Abstract
في السنوات الاخيره ، تم تسليط الضوء علي اهميه الغشاء الهيدروجيني السطحية المخاطية في المسالك الهوائية من خلال قدرتها علي تنظيم السائل سطح المجري الهوائي (أسل) الترطيب ، واللزوجة المخاط ونشاط الببتيدات المضادة للميكروبات ، والمعلمات الرئيسية المشاركة في الدفاع الفطري الرئتين. هذا هو من الاهميه الاساسيه في مجال امراض الجهاز التنفسي المزمنة مثل التليف الكيسي (CF) حيث يتم dysregulated هذه المعلمات. في حين ان مجموعات مختلفه قد درست الأس الهيدروجيني علي حد سواء في الجسم المجري وفي المختبر, أساليبهم تقرير مجموعه واسعه نسبيا من قيم الأس الهيدروجيني وحتى النتائج المتناقضة فيما يتعلق بأي اختلافات الأس الهيدروجيني بين الخلايا غير CF و CF. وعلاوة علي ذلك ، فان بروتوكولاتها لا توفر دائما ما يكفي من التفاصيل من أجل ضمان استنساخ ، ومعظمها منخفض الانتاجيه وتتطلب معدات باهظه الثمن أو معرفه متخصصة لتنفيذها ، مما يجعل من الصعب إنشاء في معظم المختبرات. هنا نقوم بوصف قارئ لوحه فلورية شبه المؤتمتة التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من الأس الهيدروجيني في ظل ظروف الفيلم رقيقه التي تشبه بشكل وثيق في الحالة المجرية. هذه التقنية تسمح لقياسات مستقره لساعات عديده من ثقافات المسالك الهوائية متعددة في وقت واحد ، والاهم من ذلك ، يمكن رصد التغيرات الديناميكية في الأس الهيدروجيني في الاستجابة لناهضات ومثبطات. ولتحقيق ذلك ، يتم تلطيخ الخلايا الظهاريه الاوليه المتمايزة بالبالكامل لمجري الهواء البشري (hAECs) بين عشيه وضحيها بصبغه حساسة لدرجه الحموضة من أجل السماح باعاده امتصاص السوائل الزائدة لضمان ظروف الأفلام الرقيقة. بعد يرصد فلوري في وجود أو عدم وجود منبات ، يتم اجراء معايره الأس الهيدروجيني في الموقع لتصحيح لحجم وصبغ تركيز. الطريقة الموصوفة توفر الضوابط المطلوبة لجعل قياسات الأس الهيدروجيني ثابته وقابله للتكرار ، والتي يمكن استخدامها في نهاية المطاف كمنصة اكتشاف المخدرات للطب الشخصي ، وكذلك تكييفها مع الانسجه الظهاريه الأخرى والتجريبية الظروف ، مثل النماذج التهابيه و/أو المضيفة المسببة للمرض.
Introduction
يتم تغطيه ظهاره المسالك الهوائية بطبقه سائله رقيقه (~ 10 μm) تسمي السائل السطحي لمجري الهواء (أسل). يتم تنظيم تكوين وعمق (الترطيب) من هذا الأمر باحكام ويتحكم في كفاءه أزاله الممرات الهوائية من قبل المصعد موكوسيلياري1,2,3,4. في السنوات الاخيره ، تم إثباتاهميه المحتوي H +/hco3– من قبل مجموعات مختلفه نظرا لقدرته علي تنظيم الترطيب الكتروني5، التهاب المسالك الهوائية6 والعدوى7، 8 وكذلك اللزوجة المخاط8،9. الأهم من ذلك ، علي الرغم من وجود بعض الخلافات ، وقد أفادت العديد من الدراسات تقلبات لدرجه الحموضة في مجري التنفس في امراض المسالك الهوائية المزمنة مثل الربو10،11،12، مرض الانسداد الرئوي11، توسع القصبات11، جيوب المزمنة13،14 والتليف الكيسي (CF)5،9،15،16،17، والتي يشير إلى ان العلاجات التي تستعيد الأس الهيدروجيني يمكن ان تكون مفيده لعلاج أنواع متعددة من امراض المسالك الهوائية المزمنة. CF هو المرض الوراثي المتنحي الأكثر شيوعا في السكان القوقاز ويرجع ذلك إلى الطفرات في الجينات المحولة الموصلات (CFTR) CF الغشاء. هذا الجين رموز انيون (hco3– و Cl–) قناه التي تلعب دورا حاسما في نقل الأيونات والسوائل والتوازن عبر النعت18. علي الرغم من ان cf هو مرض متعدد الأعضاء ، وعلم الامراض الرئة هو السبب الرئيسي للامراض والوفاات19،20 والنظر في العيب الاولي في CF هو النقل الضعيف من Cl– و hco3–، يمكن للمرء ان يفترض ان pH السائل خارج الخلية في الأشخاص الذين يعانون من CF سيتم dysregulated بالمقارنة مع الناس الذي ليس لديهم CF. التالي ، فان قياس الأس الهيدروجيني كان مجالا موضعيا للبحوث CF والمجموعات المختلفة قد وضعت تقنيات لقياس الحموضة في CF الخطوط الجويه.
في فيفو ، تم قياس درجه الحموضة الهوائية باستخدام تقنيات مختلفه ، من التحقيقات الدقيقة (ألياف البصرية ، والذهب أو التحقيقات mobidium)5،21،22،23،24 إلى قياسات الحموضة من ماده طارده للبلغم أو الزفيرالمكثفات التنفس (ebc)10،11،12،25،26،27. في مجال البحث من CF ، يتم دراسة درجه الحموضة علي نطاق واسع نظرا للآثار السريرية المحتملة. نظريا, جعل المسالك الهوائية أكثر قلوية يمكن ان تزيد من قتل البكتيريا وتحسين أزاله موكوسيلياري والتوازن مجري التنفس ككل. ومع ذلك, في المجرية/ex الدراسات فيفو تقرير مجموعه واسعه من قيم الأس الهيدروجيني, وحتى الآن, النتائج ليست حاسمه فيما يتعلق بوجود فرق في درجه الحموضة بين غير CF و cf الخطوط الجوية. في أوائل 2000s ، أفادت مجموعات مختلفه pH من EBC. في المجموعات غير المريضة ، تراوحت قيم الحموضة من 4.6 إلى 8.5 ولكن من المثير للاهتمام ، تم العثور علي ebc ph أكثر حمضيه خلال التفاقم في الناس مع CF12،27. في الاونه الاخيره ، في القياسات المجرية من النموذج العام في نماذج الإنسان والحيوانية من CF وأفادت النتائج المتضاربة16،17،21،22،23، 24 ولا يزال من غير الواضح ما إذا كانت الخطوط الجوية cf أكثر حمضيه من الخطوط الجوية غير cf.
كما هو الأمر في قياس الجسم السفلي من الأس الهيدروجيني ادني ثبت الصعب بسبب كميه صغيره جدا من بطانة السوائل المسالك الهوائية ووجود محتمل من المقابس المخاط في المرض ، وتحولت العديد من المجموعات إلى التجارب في المختبر لقياس الأس الهيدروجيني ، وذلك أساسا باستخدام ثلاثه مختلفه منهجيات. يستخدم المنهج الأول الاصباغ الفلورية الحساسة للخلايا التي يتم اضافتها كمسحوق جاف ، اما مباشره إلى المعدة أو باستخدام سائل خامل يسمي الهيدروكربون المشبع بالفلور ،5،8،16 , 17 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. ومع ذلك ، فان هذا الأسلوب يوفر القليل من السيطرة علي كميه الدقيق من الصبغة التي تضاف إلى الثقافات ويعرض خطر المجاميع صبغ والاختلافات الكبيرة في التركيز بين العينات و/أو التجارب وحتى داخل نفس العينة . وقد أجريت أيضا بشكل عام مع المجهر البؤري ، الذي يحد من قابليته للتطبيق ، وفي كثير من الحالات ، يمنع الرصد المفصل لعينات متعددة والتغيرات في شروط التسجيل. الطريقة الثانية المستخدمة لقياس الأس الهيدروجيني هو استخدام الأقطاب المجهرية الحساسة لدرجه الحموضة5,15. ولذلك فان قياسات الأس الهيدروجيني لا تعتمد علي تركيز الصبغة الفلورية وينبغي ان تعطي نتائج اقوي وأكثر استنساخا. ومع ذلك ، لا يسمح هذا الأسلوب لقياسات ديناميكية ، في الوقت الحقيقي من الأس الهيدروجيني ، وليس من السهل اجراء قراءات متعددة في ظل ظروف مختلفه. وهي أيضا عمليه كثيفه العمالة ومعقده تتطلب معدات متخصصة (أجهزه التسجيل الكهربائي/الكهربائي) والتدريب علي جمع العينات لقياس الأس الهيدروجيني اللاحق والمعايرة. وعلاوة علي ذلك ، أظهرت هاتان التقنيتان أيضا بعض التناقضات في القدرة علي إنتاج نتائج قابله للتكرار: باستخدام طريقه صبغ الفلورسنت الحساسة لدرجه الحموضة ، والقيم المبلغ عنها تانغ وآخرون 7.35 لغير CF و 7.0 لل CF أسل8 بينما في أكثر ورقه الاخيره من نفس المجموعة ، وكان الأس الهيدروجيني 6.9 و 6.4 لغير CF و CF ، علي التوالي17. وبطريقه مماثله ، أعطت قياسات القطب المجهري قيم 6.4 في غير-CF و6.1 في الدراسة من 200315 في حين ان المجموعة نفسها أبلغت عن قيم 6.7 لغير cf و 6.45 ل cf أسل في دراسة من 20135. وأخيرا ، في النهج الثالث ، يضيف الباحثون حجما كبيرا نسبيا من المحلول المخزن بشكل ضعيف علي السطح المخاطي للثقافات ، التالي يدمرون ظروف الأفلام الرقيقة ويغيرون تكوين الجهاز ، ويحتمل ان يكون تنظيمه. ثم يقاس الأس الهيدروجيني اما باستخدام الاصباغ الفلورية الحساسة لدرجه الحموضة33، من خلال طريقه المعايرة بالقياس الهيدروجيني لدرجه الحموضة في غرفه الاستعمال13،14، أو يتطلب أزاله الأس المخفف من الثقافات وقياس درجه الحموضة باستخدام درجه الحموضة القطب ، محلل أو عباد الربيع شرائط34. ومن الصعوبات الأخرى في القياس الدقيق لدرجه الحموضة الهيدروجينية إنشاء منحني قياسي دقيق قدر الإمكان. في الواقع ، ما إذا كان يتم تنفيذ القراءات مع القطب الذي سيقيس الفرق في الطاقة الكهربائية عن طريق الراتنج أو استخدام الاصباغ الفلورية الحساسة لدرجه الحموضة ، سيتاثر كل من هذه النهج من البيئة المحلية الصغيرة للعينات يجري قياس. وبشكل أكثر تحديدا ، قد يختلف ثابت التفكك (Kd) من الاصباغ بشكل كبير اعتمادا علي درجه الحرارة ، والقوه الايونيه ، واللزوجة ، فضلا عن التفاعلات المحتملة للصبغة مع المكونات الخلوية مثل البروتينات والمخاط المحتمل.
من أجل محاولة التغلب علي العديد من هذه القضايا التقنية ، وكذلك لتطوير طريقه أكثر ديناميكية وابسط واعلي الانتاجيه ، انشانا تقنيه في المختبر الذي يسجل الأس الهيدروجيني في الثقافات hAEC الاوليه باستخدام خليه-التي تهدد pH الحساسة صبغه فلورية في القياسية التجارية لوحه القارئ. وتقوم هذه الطريقة بإنشاء قياسات قابله للتكرار وديناميكية وشبه مؤتمتة وفي الوقت الحقيقي لدرجه الحموضة من الخلايا ثلاثية الابعاد المتمايزة تماما في ظل ظروف الأفلام الرقيقة. من خلال استخدام قارئ لوحه متعددة البئر ، يمكن لهذا الفحص شبه الألى جعل القياسات المتزامنة القريبة من درجه الحموضة لمده تصل إلى 24 الظروف أكثر من 12 h ويمكن رصد تاثير أضافه منبات مختلفه أو مثبطات. في هذه الورقة نقوم بوصف المنهجية بالتفصيل والإبلاغ عن النتائج التمثيلية في ظل ظروف الرقابة الايجابيه والسلبية التي تتحقق من صحة هذه التقنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم بروتوكولا مفصلا لقياس ديناميكية من الأس الهيدروجيني في الخلايا الظهاريه مجري التنفس البشري الاولي. وتشمل الخطوات الحاسمة غسل المخاط قباله سطح قمي من الخلايا ، وقياس وطرح الخلفية باستخدام نفس المعلمات كما في التجربة ، وتحسين الموقف z والحصول علي وأداء معايره الأس الهيدروجيني في الموقع.
الخطوة الاولي من غسل الخلايا حاسمه كطبقه سميكه من المخاط قد (ط) منع الاصباغ من الوصول إلى طبقه بيريسيلياري (PCL) و (2) تاخير أو منع الكشف عن التغيرات في فلوري استجابه لناهضات/مثبطات. وقد وضعت طريقتنا لدراسة كيفيه الاساسيه haecs التضمين نشاط hco3– وH + الناقلين في استجابه لناهضات. في حين انه سيكون من المثير للاهتمام للتحقيق في كيفيه التغييرات في PCL الأس الهيدروجيني تتعلق التغيرات في الحموضة المخاط, هناك حاجه إلى مزيد من التطوير لهذا البروتوكول, بما في ذلك استخدام الوزن الجزيئي المختلفة-dextrans إلى الهدف بشكل متفاوت 2 طبقات و z-بالمسح من خلال الجميع.
ويعد قياس الخلفية خطوه هامه أخرى في هذا البروتوكول. السطح قمي من التمايز الكامل الابتدائية المسالك الهوائية ونادرا ما تكون مسطحه تماما والتي سوف تؤثر علي مسار الضوء التالي الخلفية. التاكد من ان قراءات الخلفية يتم تنفيذها في نفس النقاط المحلية من الآبار كما في اثناء التجربة أمر بالغ الاهميه لاستنساخ واستقرار التسجيلات.
تحسين الوضع z والكسب هي الخطوات الضرورية التي تحتاج إلى اعداد لكل تركيز مختلفه من صبغ الفلورسنت التي سيتم استخدامها. وهذا من شانه ان يمنع ارتفاع التباين بين التجارب. وبمجرد الاعداد ، فان فحصنا يوفر نتائج مستقره وقابله للتكرار. واحده من الأسباب لذلك هو ان تضاف الاصباغ علي سطح قمي علي الخلايا في حجم صغير من السوائل التي يتم امتصاصها بسهوله من قبل ظهاره ، وترك المسمي المتجانسة أسل. طريقه أخرى لوصمه عار ، التي يمكن ان تكون ناجحه علي قدم المساواة ، وتستخدم مسحوق جاف أو “تعليق” في القوات الخاصة. علي الرغم من ان هذا قد يكون الوقت–إنقاذ (كما يتم اجراء التجارب عاده في غضون 2 h) ، فمن غير المرجح ان الاصباغ الجافة جعل تماما في أسل التالي قد شكل كتل. التالي سيتم العثور علي تركيزات مختلفه من صبغه حساسة لدرجه الحموضة علي سطح الخلايا الظهاريه.
وتعد معايره درجه الحموضة في الموقع خطوه هامه من أجل الحصول علي نتائج دقيقه وقابله للتكرار. وكما هو مبين وموضح في قسم النتائج ، فان الاختلافات في احجام الكميات الكترونيه ستؤثر علي العدد الفلوري التالي علي قيم الحموضة المحرفة (الشكل 2 والشكل 3). في حين ان مجموعات مختلفه قد نشرت في السابق قياسات الأس الهيدروجيني ، وقد تم الحصول علي مجموعه واسعه من القيم حتى بين الدراسات المختلفة التي نشرتها نفس المجموعة8،17. ونحن نعتقد انه من خلال القيام بالمعايرة في الموقع ، ستصبح النتائج أكثر قابليه للتكرار. بالمقارنة مع غيرها من تقنيات معايره الأسالهيدروجيني ، والتي تستخدم عاليه ك +/نيجري (أو العديد من ionophores) طريقه لتوليد منحني القياسية28،29،30، والفحص المقدمة هنا لديه ميزه ان ، طالما يتم تنفيذ كل خطوه في مجلس الوزراء السلامة ، والخلايا المستخدمة في الأس الهيدروجيني يمكن غسلها ، والاحتفاظ بها وأعاده استخدامها للتجارب الأخرى شريطه ان العلاجات التي أجريت لا تؤثر بشكل لا رجعه فيه علي الخلايا الظهاريه.
وقد قدم تطوير والاستفادة المثلي من هذا الفحص نتائج استنساخه ، ونحن نعتقد ان هذه الطريقة سوف تساعد المجموعات الأخرى مع قياس الأس الهيدروجيني الخاص بهم. ومع ذلك ، يحتوي هذا الأسلوب أيضا بعض القيود بسبب اعداد ونوع الخلايا التي يتم استخدامها. رصد الأس الهيدروجيني علي مدي فتره زمنيه أطول من التي قدمت هنا (> 8-10 ح) قد يكون من الصعب كما بيئة عاليه الرطوبة طويلة الأجل قد تضر المعدات وحقيقة ان معظم القراء لوحه تقدم فقط خيار لتسجيل قراءات الحركية علي مدي مقدار معين من الوقت (عاده 24 ساعة). استخدام haecs الابتدائية متمايزة تماما أمر حاسم في الطريقة التي مراحل مختلفه من التمايز سوف تؤثر علي التعبير عن hco3– وH + الناقلين. ومع ذلك ، هناك تقريبا اي امكانيه للسيطرة بدقه علي حجم الخلية في الخلايا المزروعة في ظل ظروف الفيلم رقيقه. وكما ذكر في أقسام البروتوكول والنتائج ، فان التغيرات في الحجم ستؤثر علي نسبه الفلورية ومن الضروري للأسف ان نفترض انه في الخلايا المزروعة من فرد واحد ، مصنفه في نفس اليوم علي دعامات مختلفه شبه منفذه ، مجلدات أسل ستكون هي نفسها. الناشئة عن هذا القيد ، اي ناهض أو مثبط من شانها ان تؤثر علي إفراز السوائل أو الامتصاص سوف تؤثر علي حجم أسل ويفترض نسب الفلورية. ومع ذلك ، في فحص لدينا ، يتم تنفيذ منحني المعايرة في نهاية التجربة ، لذلك يمكننا ان نفترض ان هذه التغييرات في حجم سوف تؤثر علي نسب المعايرة بنفس الطريقة كما هو الحال اثناء التجربة الحركية. لهذا السبب نحن ننصح المجموعات التي من شانها ان تكون مهتمة في تطوير هذا الفحص ، لاستخدام ما لا يقل عن 2-3 نسخ متماثلة لكل حاله اختبار لان هذا سيسمح لإنشاء منحني قياسي لكل شرط.
هنا نقدم بسيطه ، شبه الألى ، الفحص الذي يسمح قياس الوقت الحقيقي لدرجه الحموضة سطح الغشاء المخاطي في ظل ظروف رقيقه الفيلم. وهي تتمتع بالقدرة علي التحقيق في الاستجابات الديناميكية لدرجه الحموضة في العديد من الثقافات بطريقه شبه متزامنة تسمح باجراء مقارنات بين المانحين وداخلهم. رفع مستوي هذا الأسلوب إلى شكل لوحه بشكل جيد 96 باستخدام نظام الاستقطاب (لوحات الهيئة 96 جيدا)38 سيوفر إنتاجيه اعلي حتى كفحص اكتشاف المخدرات. وعلاوة علي ذلك ، لقد أظهرنا كيف يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة التاثير الحاد لناهضات علي الأس الهيدروجيني ، ونحن قد نشرت بالفعل ان هذه الطريقة يمكن استخدامها لدراسة تاثير طويل الأجل من مثبطات مضخة البروتون قمي علي CF haecs أسل39. كما ثبت الأس الهيدروجيني لتنظيم العدوى, التهاب, اللزوجة المخاط والنقل الأيوني, تحديد الأهداف الجزيئية التي يمكن ان تزيد من درجه الحموضة ستكون قيمه في مجالات البحث من امراض الرئة المزمنة وهذه التقنية من المحتمل ان تسهل تطوير فحص المخدرات في نهج الطب الشخصي. وأخيرا ، نظرا لان تقلبات في قاعده التوازن الحمضية يلعب دورا رئيسيا في الامراض الأخرى ، يمكن تكييف هذا البروتوكول ، مع خطوات التحسين ، للمعدات المختلفة (لوحه القراء) وأنواع الخلايا ، مثل الخلايا الظهاريه الأخرى. الحموضة خارج الخلية هو سمه من سمات السرطان40،41،42 وهذا الفحص يمكن ان تساعد في تحديد كيفيه إنتاج الأورام الصلبة منخفضه الحموضةe أو يمكن استخدامها كفحص المخدرات الانتاجيه المنخفضة استعاده التوازن الهيدروجيني. المثل ، وفيما يتعلق بامراض المسالك التنفسية المزمنة ، فانها يمكن ان توفر أيضا منصة لتطوير نهج الطب الشخصي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا العمل بدعم اثنين من منح مركز البحوث الاستراتيجية التابع للصندوق الاستئماني CF (SRC003 و SRC013) ومنحه الثقة في المفاهيم الصادرة عن مجلس البحوث الطبية (MC_PC_15030). تم دعم JG من قبل منحه من مؤسسه البحوث الطبية (MRF-091-0001-RG-GARNE). [مب] كان ساندت ب [مديكل رسرش] طبية [كلينتيمن] عالم زمالة ([مستر/M008797/1]). وقد تم دعم IH من قبل زمالة التدريب السريري الثقة Wellcome (203520/Z/16/Z). تم دعم البحث من قبل المعهد الوطني للبحوث الصحية نيوكاسل مركز البحوث الطبية الحيوية مقرها في مستشفيات نيوكاسل المؤسسة الاستئمانية للصحة وجامعه نيوكاسل. الآراء المعرب عنها هي تلك التي للمؤلف (المؤلفين) وليس بالضرورة تلك الخاصة بالدائرة الصحية الخاصة أو المعهد النيجيري للصحة أو وزاره الصحة. تم دعم الخلايا الاوليه من الدكتور رانديل من قبل منحه مؤسسه التليف الكيسي (BOUCHE15R0) ومنحه المعاهد القومية للصحة (P30DK065988).
Materials
| 0.2 µm syringe filter | Starlab | E4780-1226 | |
| 6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3470 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
| CFTRInh172 | RnD Systems (Tocris) | 3430 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM |
| Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
| dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran | ThermoFisher | D22910 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
| dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran | ThermoFisher | P10361 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Forskolin | RnD Systems (Tocris) | 1099 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Cellstar | 655180 | |
| Humidity cassette | TECAN | 30090495 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
| MES | Sigma Aldrich | M3885 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaHepes | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Plate reader: TECAN SPARK 10M | TECAN | 30086375 | |
| Tris | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Universal pH electrodes DJ 113 | VWR | 662-1385 |
References
- Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 150 (1), 271-281 (1994).
- Roomans, G. M., et al. Measurements of airway surface liquid height and mucus transport by fluorescence microscopy, and of ion composition by X-ray microanalysis. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 135-139 (2004).
- Haq, I. J., Gray, M. A., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M. Airway surface liquid homeostasis in cystic fibrosis: pathophysiology and therapeutic targets. Thorax. 71 (3), 284-287 (2016).
- Martin, S. L., Saint-Criq, V., Hwang, T. C., Csanady, L. Ion channels as targets to treat cystic fibrosis lung disease. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2S), S22-S27 (2018).
- Garland, A. L., et al. Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15973-15978 (2013).
- Torres, I. M., Patankar, Y. R., Berwin, B. Acidosis exacerbates in vivo IL-1-dependent inflammatory responses and neutrophil recruitment during pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (2), L225-L235 (2018).
- Berkebile, A. R., McCray, P. B. Effects of airway surface liquid pH on host defense in cystic fibrosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 124-129 (2014).
- Tang, X. X., et al. Acidic pH increases airway surface liquid viscosity in cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 879-891 (2016).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Hunt, J. F., et al. Endogenous airway acidification. Implications for asthma pathophysiology. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161, 694-699 (2000).
- Kostikas, K., et al. pH in expired breath condensate of patients with inflammatory airway diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (10), 1364-1370 (2002).
- Ojoo, J. C., Mulrennan, S. A., Kastelik, J. A., Morice, A. H., Redington, A. E. Exhaled breath condensate pH and exhaled nitric oxide in allergic asthma and in cystic fibrosis. Thorax. 60 (1), 22-26 (2005).
- Cho, D. Y., Hajighasemi, M., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Proton secretion in freshly excised sinonasal mucosa from asthma and sinusitis patients. American Journal of Rhinology & Allergy. 23 (6), e10-e13 (2009).
- Cho, D. Y., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Acid and base secretion in freshly excised nasal tissue from cystic fibrosis patients with DeltaF508 mutation. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (2), 123-127 (2011).
- Coakley, R. D., et al. Abnormal surface liquid pH regulation by cultured cystic fibrosis bronchial epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 16083-16088 (2003).
- Pezzulo, A. A., et al. Reduced airway surface pH impairs bacterial killing in the porcine cystic fibrosis lung. Nature. 487 (7405), 109-113 (2012).
- Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).
- Saint-Criq, V., Gray, M. A. Role of CFTR in epithelial physiology. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (1), 93-115 (2017).
- . ECFS Patient Registry Annual Data Report Available from: https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf (2016)
- . Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2017 Available from: https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2017)
- Abou Alaiwa, M. H., et al. Neonates with cystic fibrosis have a reduced nasal liquid pH; a small pilot study. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (4), 373-377 (2014).
- Abou Alaiwa, M. H., et al. Ivacaftor-induced sweat chloride reductions correlate with increases in airway surface liquid pH in cystic fibrosis. JCI Insight. 3 (15), (2018).
- McShane, D., et al. Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 21 (1), 37-42 (2003).
- Schultz, A., et al. Airway surface liquid pH is not acidic in children with cystic fibrosis. Nature Communications. 8 (1), 1409 (2017).
- Abou Alaiwa, M. H., et al. Repurposing tromethamine as inhaled therapy to treat CF airway disease. JCI Insight. 1 (8), (2016).
- Ngamtrakulpanit, L., et al. Identification of Intrinsic Airway Acidification in Pulmonary Tuberculosis. Global Journal of Health Science. 2 (1), 106-110 (2010).
- Tate, S., MacGregor, G., Davis, M., Innes, J. A., Greening, A. P. Airways in cystic fibrosis are acidified: detection by exhaled breath condensate. Thorax. 57 (11), 926-929 (2002).
- Jayaraman, S., Song, Y. Airway surface liquid pH in well-differentiated airway epithelial cell cultures and mouse trachea. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 281 (5), C1504-C1511 (2001).
- Jayaraman, S., Song, Y., Vetrivel, L., Shankar, L., Verkman, A. S. Noninvasive in vivo fluorescence measurement of airway-surface liquid depth, salt concentration, and pH. Journal of Clinical Investigation. 107 (3), 317-324 (2001).
- Lennox, A. T., et al. ATP12A promotes mucus dysfunction during Type 2 airway inflammation. Scientific Reports. 8 (1), 2109 (2018).
- Song, Y., Thiagarajah, J., Verkman, A. S. Sodium and chloride concentrations, pH, and depth of airway surface liquid in distal airways. The Journal of General Physiology. 122 (5), 511-519 (2003).
- Thiagarajah, J. R., Song, Y., Haggie, P. M., Verkman, A. S. A small molecule CFTR inhibitor produces cystic fibrosis-like submucosal gland fluid secretions in normal airways. FASEB Journal. 18 (7), 875-877 (2004).
- Garnett, J. P., et al. Hyperglycaemia and Pseudomonas aeruginosa acidify cystic fibrosis airway surface liquid by elevating epithelial monocarboxylate transporter 2 dependent lactate-H(+) secretion. Scientific Reports. 6, 37955 (2016).
- Gorrieri, G., et al. Goblet Cell Hyperplasia Requires High Bicarbonate Transport To Support Mucin Release. Scientific Reports. 6, 36016 (2016).
- Randell, S. H., Fulcher, M. L., O’Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods in Molecular Biology. 742, 285-310 (2011).
- Fulcher, M. L., Randell, S. H. Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture. Methods in Molecular Biology. , 109-121 (2013).
- Matsui, H., et al. Evidence for periciliary liquid layer depletion, not abnormal ion composition, in the pathogenesis of cystic fibrosis airways disease. Cell. 95 (7), 1005-1015 (1998).
- Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. npj Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
- Delpiano, L., et al. Esomeprazole Increases Airway Surface Liquid pH in Primary Cystic Fibrosis Epithelial Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1462 (2018).
- Gillies, R. J., Liu, Z., Bhujwalla, Z. 31P-MRS measurements of extracellular pH of tumors using 3-aminopropylphosphonate. American Journal of Physiology. 267 (1 Pt 1), C195-C203 (1994).
- Tannock, I. F., Rotin, D. Acid pH in tumors and its potential for therapeutic exploitation. Cancer Research. 49 (16), 4373-4384 (1989).
- Wike-Hooley, J. L., Haveman, J., Reinhold, H. S. The relevance of tumour pH to the treatment of malignant disease. Radiotherapy and Oncology. 2 (4), 343-366 (1984).
