Summary

הייצור של שלב מיקרוסקופ להתבוננות אנכית עם הפונקציה בקרת טמפרטורה

Published: July 31, 2019
doi:

Summary

המוצג כאן הוא פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ טמפרטורה שבשליטת המצב המאפשר מכולה לדוגמה להיות רכוב על מיקרוסקופ אנכי.

Abstract

הדגימות ממוקמות בדרך כלל על מיקרוסקופ אופקי להתבוננות מיקרוסקופית. עם זאת, כדי להתבונן ההשפעה של הכבידה על מדגם או לחקור התנהגות הצפה, יש צורך להפוך את הבמה המיקרוסקופ אנכית. כדי להשיג זאת, מיקרוסקופ הפוכה הצידה מוטה על ידי 90 ° כבר המציאו. כדי להתבונן בדגימות במיקרוסקופ זה, יש לאבטח מכולות כגון מנות פטרי או מגלשות זכוכית לשלב האנכי. מכשיר שיכול לאבטח מכולות לדוגמה במקום על במת מיקרוסקופ אנכי פותחה והוא מתואר כאן. ההחזקה של התקן זה לבמה מאפשרת התבוננות של דינמיקה לדוגמה במישור האנכי. היכולת לווסת את הטמפרטורה באמצעות דוד גומי סיליקון גם מאפשר התבוננות של התנהגויות לדוגמה תלויי טמפרטורה. יתר על כן, נתוני הטמפרטורה מועברים לשרת אינטרנט. ניתן לשלוט בהגדרות הטמפרטורה ובניטור יומן הרישום מרחוק ממחשב או מטלפון חכם.

Introduction

מיקרוסקופ אופטי היא טכניקה המועסקים כדי להגדיל את הפרטים הנצפה באמצעות הגדלה של מדגם עם עדשות ואור גלוי. במיקרוסקופיה אופטית, אור מופנה למדגם, ולאחר מכן משודר, משתקף, או אור ניאון נתפס על ידי עדשות מגדלת להתבוננות. סוגים שונים של מיקרוסקופ זמינים שונים בעיצוב כדי להתאים שימושים שונים ושיטות התבוננות. העיצובים השונים כוללים מיקרוסקופ זקוף, הבנוי להאיר מדגם מלמטה להתבוננות מלמעלה, ומיקרוסקופ הפוך, המאיר את המדגם מלמעלה להתבוננות מלמטה. מיקרוסקופים זקופה הם העיצוב הנפוץ ביותר בשימוש נרחב. מיקרוסקופים הפוכים משמשים לעתים קרובות כדי להתבונן בדגימות שאינן יכולות לאפשר לעדשה להיסגר במרחק מלמעלה, כגון תאים מתורבתים העומדים בתחתית המיכל. קבוצות מחקר רבות דיווחו על תצפיות במגוון רחב של שדות באמצעות מיקרוסקופים הפוכה1,2,3,4,5,6,7. התקנים נוספים רבים פותחו גם כי לנצל את התכונות של מיקרוסקופים הפוכה8,9,10,11,12,13 .

כיום, בכל העיצובים המקובלים במיקרוסקופ, בשלב המיקרוסקופ הוא אופקי ולכן הוא לא מתאים להתבוננות של דגימות הפקת תנועה במישור האנכי, (בשל כוח הכבידה, ציפה, תנועה, וכו ‘). כדי לגרום לתצפיות אלה להיות אפשריות, יש לסובב את שלב המיקרוסקופ ואת הנתיב האור לאנכי. השלב האנכי נדרש להרכבה אנכית של שקופיות זכוכית או לדוגמה מכולות כגון מנות פטרי לבמה. כדי לענות על כך, מיקרוסקופ הפוכה הצידה מוטה על ידי 90 ° כבר המציאו. עם זאת, הצמדת דגימות באמצעות קלטת או דבקים אחרים אינה מהווה את היכולת הדרושה לניידות ארוכת טווח. המתואר כאן הוא מכשיר שיכול להשיג את היציבות הנדרשת. התקן זה מאפשר תצפית לאורך זמן של תנועה לדוגמה במישור האנכי. הרכבה של דוד גומי סיליקון גם עשה את זה ניתן לצפות את ההשפעה של וריאציה טמפרטורה על התנהגות מדגם. נתוני הטמפרטורה מועברים לשרת אינטרנט על-ידי Wi-Fi, והגדרות הטמפרטורה וניטור היומן ניתנים לשליטה מרחוק ממחשב או מטלפון חכם. לידיעתך, השלב המצורף למיקרוסקופ מוטה לצדדים, שוטה על ידי 90 °, עדיין לא דווח במחקרים קודמים.

בשלב המיקרוסקופ מורכב שלושה צלחות אלומיניום. לוחית האלומיניום האמצעית מותקן לצלחת האלומיניום התחתונה המתחבר לבמה. גומי הסיליקון המכיל את חיישן הטמפרטורה מחובר בין לוחיות האלומיניום האמצעיות באמצע ובחלק העליון. גומיות משמשות להצמיד את המדגם. טפרים הם מחוברים בשמאל ובימין ארבע נקודות של צלחת האלומיניום העליון כדי לאבטח את להקות גומי. מעגל הבקרה של וסת הטמפרטורה מקבל אות מחיישן הטמפרטורה מוטבע גומי סיליקון ומודולציה חשמל באמצעות אפנון רוחב הדופק (PWM) שיטה. ניתן להגדיל בהדרגה את הטמפרטורה ל-50 ° c בהפרשים של 1 ° c. התקן זה שימושי עבור יישומים שבהם תנועות לדוגמה אנכית עשויות להיות תלויות טמפרטורה.

דו ח זה מספק דוגמאות לאפקטי טמפרטורה על התופעה הצפה של דיטומים. כדוגמאות של צורניות לימודי תצפית, מדידות של מהירות משקעי מצברים של אשכולות תאים, ניתוח תנועה, לימודי מבנה ultrafine, וכו ‘ דווחו14,15,16,17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , 23. הכבידה הספציפית של דיאטומים הצפים במים עם אורגניזמים פוטוסינתטיים הוא מעט גבוה יותר מזה של מים, כך הם נוטים לשקוע; עם זאת, הם יעלו אם אפילו הסעה קלה מתרחשת. כדי ללמוד תופעה זו, שקופית זכוכית מודבקת אנכית לשלב המיקרוסקופ, ואת ההשפעות של הטמפרטורה הגוברת על התנועה האנכית צורניות הם נצפו.

Protocol

1. עיצוב ייצור פלטות אלומיניום חותכים חור 101 מ”מ במרכז של צלחת אלומיניום של מידות 150 mm x 200 mm x 2 מ”מ לשמש צלחת החזית עם מכונת עיבוד לייזר. מכונת טפרים בשמונה נקודות להצמיד שתי רצועות גומי באורך, או שתיים לרוחב הצלחת הזאת (ראה משלים איור 1a ומשלים איור 2a). חותכים חו…

Representative Results

איור 2 מראה את התפלגות הטמפרטורה של דוד הגומי. טמפרטורת פני השטח של הדוד הגומי היה אחיד בכל טמפרטורה. איור 3 מראה את התגובתיות של הטמפרטורה נמדד כדי לקבוע שינויי טמפרטורה. הקו הכתום מציג את טמפרטורת הערכה והקו הכחול מציג את השינוי בטמפרטורת…

Discussion

ניתוח מסלול של תאים מתקדמים בתאי האטום הוא גישה שימושית להערכת הטיפול בדיאטום. עם זאת, בעוד מיקרוסקופ הפוכה נורמלי מתבונן דגימות אופקית, הוא אינו מתאים לתצפיות על השפעת הכבידה או תנועה צפה בכיוון האנכי. פיתח ותיאר כאן הוא שלב מיקרוסקופ אנכי עם בקרת טמפרטורה מוצמד מיקרוסקופ הפוך, אשר מסובב?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

. למחברים אין תודות

Materials

AC adapter 12V2A Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. AD-D120P200 Tokyo, Japan
ADS1015 Substrate Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. adafruit PRODUCT ID: 1083 Tokyo, Japan
Alminium Plate (Back Side Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200㎜×T 1.5mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Forefront Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200㎜×T 2mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Lower Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200㎜×T 4mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Upper Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200㎜×T 5mm Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Lower Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Upper Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution Sigma-Aldrich Co. LLC B5282-500ML St. Louis, USA
Controller Case Marutsu Elec Co., Ltd. pff-13-3-9 Tokyo, Japan
CPU Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. ESP-WROOM-02D Tokyo, Japan
Inverted microscope Olympus Corporation CKX 53 Tokyo, Japan
Low temperature hardening epoxy resin adhesive ThreeBond Co., Ltd. TB2086M Tokyo, Japan
Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. 3296W-1-501LF Tokyo, Japan
OLED module Akihabara Inc. M096P4W Tokyo, Japan
Pressed Cork (For supporting electrode ) Tera Co., Ltd. W 42mm×L 30㎜ Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Lower Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 0.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Upper Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Rotary encoder with switch with 2 color LED Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. P-05772 Tokyo, Japan
Silicone rubber heater Three High Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Kanagawa, Japan
Substrate Seeed Technology Co., Ltd. mh5.0 Shenzhen, China
Temperature sensor Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. NXFT15XH103FA2B050 Tokyo, Japan
Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V Marutsu Elec Co., Ltd. BR301 Tokyo, Japan
Universal Flexible Arm Banggood Technology Co., Ltd. YP-003-2 Hong Kong, China
USB cable USB-A – MicroUSB Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. USB CABLE A-MICROB Tokyo, Japan
Video Canera Sony Corporation HDR-CX590 Tokyo, Japan

References

  1. Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
  2. McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
  3. Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
  4. Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
  5. Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
  6. Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
  7. Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM – selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
  8. Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
  9. Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
  10. Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
  11. Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
  12. Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
  13. Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
  14. Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
  15. Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
  16. Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
  17. Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields – A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
  18. Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
  19. Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
  20. Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
  21. Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates – potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
  22. Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
  23. Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion – An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).

Play Video

Cite This Article
Matsukawa, Y., Ide, Y., Umemura, K. Fabrication of Microscope Stage for Vertical Observation with Temperature Control Function. J. Vis. Exp. (149), e59799, doi:10.3791/59799 (2019).

View Video