Изготовление стадии микроскопа для вертикального наблюдения с функцией контроля температуры
Summary
Здесь представлен протокол с использованием контролируемого температурой стадии микроскопа, который позволяет образец контейнера, который будет установлен на вертикальном микроскопе.
Abstract
Образцы обычно помещаются на горизонтальную стадию микроскопа для микроскопического наблюдения. Однако, чтобы наблюдать влияние гравитации на образец или изучать поведение на плаву, необходимо сделать микроскоп этапом вертикальной. Для этого был разработан боковой перевернутый микроскоп, наклоненный на 90 градусов. Для наблюдения за образцами с помощью этого микроскопа, образцы контейнеров, таких как петри блюда или стеклянные слайды должны быть закреплены на сцене вертикально. Разработано и описано здесь устройство, которое может обеспечить безопасность контейнеров для образцов на месте на этапе вертикального микроскопа. Прикрепление этого устройства к этапу позволяет наблюдать за динамикой образца в вертикальной плоскости. Способность регулировать температуру с помощью силиконового резинового нагревателя также позволяет наблюдать за температурно-зависимым поведением образца. Кроме того, данные о температуре передаются на интернет-сервер. Настройки температуры и мониторинг амортизанов можно управлять удаленно с ПК или смартфона.
Introduction
Оптическая микроскопия является методом, используемым для увеличения наблюдаемых деталей через увеличение образца с линзами и видимым светом. В оптической микроскопии свет направляется на образец, затем передается, отражается или флуоресцентный свет захватывается увеличительными линзами для наблюдения. Различные типы микроскопа доступны, которые отличаются по дизайну для размещения различных применений и методов наблюдения. Различные конструкции включают в себя вертикально микроскоп, который структурирован, чтобы осветить образец снизу для наблюдения сверху, и перевернутый микроскоп, который освещает образец сверху для наблюдения снизу. Вертикально микроскопы являются наиболее распространенными и широко используемыми дизайном. Перевернутые микроскопы часто используются для наблюдения образцов, которые не могут позволить объектив близко на расстоянии от выше, таких как культивированные клетки приверженцев нижней части контейнера. Многие исследовательские группы сообщили наблюдений в широком диапазонеобластей с использованием перевернутых микроскопов 1,2,3,4,5,6,7. Многие дополнительные устройства были также разработаны, которые используют возможности перевернутые микроскопы8,9,10,11,12,13 .
В настоящее время, во всех обычных конструкций микроскопа, микроскоп этап горизонтальной и поэтому не подходит для наблюдения образцов производства движения в вертикальной плоскости, (из-за тяжести, плавучести, движения и т.д.). Для того чтобы эти наблюдения стали возможными, этап микроскопа и световой путь должны быть повернуты в вертикальные. Вертикальная стадия необходима для вертикального крепления стеклянных горок или образцов контейнеров, таких как посуда Петри на сцену. Для решения этой проблемы уже разработан боковой перевернутый микроскоп, наклоненный на 90 градусов. Однако присоединение образцов лентой или другими клеями не дает необходимой долгосрочной неподвижности. Описано здесь устройство, которое может достичь необходимой стабильности. Это устройство позволяет наблюдать за ходом образца в вертикальной плоскости. Установка кремниевого резинового нагревателя также позволила наблюдать влияние изменения температуры на поведение образца. Температурные данные передаются на интернет-сервер с помощью Wi-Fi, а настройки температуры и мониторинг амортизации могут управляться удаленно с ПК или смартфона. Насколько нам известно, этап, прикрепленный к наклонному микроскопу в сторону, наклонен на 90 градусов, еще не сообщалось в предыдущих исследованиях.
Стадия микроскопа состоит из трех алюминиевых пластин. Средняя алюминиевая пластина крепится к нижней алюминиевой пластине, которая крепится к сцене. Силиконовая резина, содержащая датчик температуры, крепится между средними и верхними алюминиевыми пластинами. Резиновые ленты используются для крепления образца. Когти крепятся в левой и правой четырех точках верхней алюминиевой пластины для обеспечения резинки. Схема управления температурным регулятором получает сигнал от датчика температуры, встроенного в силиконовую резину, и модулирует электроэнергию методом модуляции ширины импульса (PWM). Температура может быть постепенно увеличена до 50 градусов с шагом в 1 градус Цельсия. Это устройство полезно для приложений, в которых вертикальные движения образца могут быть зависимы от температуры.
В настоящем докладе приводятся примеры воздействия температуры на плавающее явление диатомовых. В качестве примеров диатомных исследований, измерений скорости осадочных отложений клеточных кластеров, анализа движения, ультратонких исследований структуры и т.д. были зарегистрированы14,15,16,17 , 18 лет , 19 лет , 20 , 21 год , 22 Г. , 23. Специфическая гравитация диатомовых организмов, плавающих в воде с фотосинтетическими организмами, немного выше, чем у воды, поэтому они, как правило, тонут; однако, они будут расти, если даже небольшая конвекция происходит. Для изучения этого явления, стеклянный слайд крепится вертикально к стадии микроскопа, и влияние повышения температуры на диатоме вертикального движения наблюдаются.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ траектории движущихся диатомовых клеток является полезным подходом к оценке подвижности диатома. Однако, в то время как нормальный перевернутый микроскоп наблюдает образцы горизонтально, он не подходит для наблюдений за воздействием гравитации или плавающим движением в верти…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы не имеют подтверждений.
Materials
| AC adapter 12V2A | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | AD-D120P200 | Tokyo, Japan |
| ADS1015 Substrate | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | adafruit PRODUCT ID: 1083 | Tokyo, Japan |
| Alminium Plate (Back Side Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 1.5mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Forefront Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 2mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 4mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 5mm | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution | Sigma-Aldrich Co. LLC | B5282-500ML | St. Louis, USA |
| Controller Case | Marutsu Elec Co., Ltd. | pff-13-3-9 | Tokyo, Japan |
| CPU | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | ESP-WROOM-02D | Tokyo, Japan |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | CKX 53 | Tokyo, Japan |
| Low temperature hardening epoxy resin adhesive | ThreeBond Co., Ltd. | TB2086M | Tokyo, Japan |
| Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | 3296W-1-501LF | Tokyo, Japan |
| OLED module | Akihabara Inc. | M096P4W | Tokyo, Japan |
| Pressed Cork (For supporting electrode ) | Tera Co., Ltd. | W 42mm×L 30㎜ | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Lower Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 0.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Upper Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Rotary encoder with switch with 2 color LED | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | P-05772 | Tokyo, Japan |
| Silicone rubber heater | Three High Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Kanagawa, Japan |
| Substrate | Seeed Technology Co., Ltd. | mh5.0 | Shenzhen, China |
| Temperature sensor | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | NXFT15XH103FA2B050 | Tokyo, Japan |
| Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V | Marutsu Elec Co., Ltd. | BR301 | Tokyo, Japan |
| Universal Flexible Arm | Banggood Technology Co., Ltd. | YP-003-2 | Hong Kong, China |
| USB cable USB-A – MicroUSB | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | USB CABLE A-MICROB | Tokyo, Japan |
| Video Canera | Sony Corporation | HDR-CX590 | Tokyo, Japan |
References
- Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
- McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
- Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
- Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
- Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM – selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
- Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
- Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
- Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
- Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
- Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
- Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
- Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
- Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
- Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
- Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields – A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
- Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
- Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
- Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
- Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates – potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
- Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
- Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion – An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).
