Fabricage van de Microscoop fase voor verticale observatie met temperatuur regelfunctie
Summary
Hier gepresenteerd is een protocol met behulp van een temperatuur gecontroleerde Microscoop fase die het mogelijk maakt een monster container te monteren op een verticale Microscoop.
Abstract
Monsters worden meestal op een horizontale Microscoop-fase geplaatst voor microscopische observatie. Echter, om de invloed van de zwaartekracht op een monster of studie drijven gedrag te observeren, is het noodzakelijk om de Microscoop fase verticaal te maken. Om dit te bereiken, is een zijwaartse omgekeerde Microscoop gekanteld met 90 ° bedacht. Om monsters met deze Microscoop te observeren, moeten Monsterhouders zoals Petri schalen of glaasjes verticaal op het podium worden vastgezet. Er is een apparaat ontwikkeld dat de Monsterhouders op een verticale Microscoop-fase kan beveiligen en hier wordt beschreven. Bevestiging van dit apparaat aan het werkgebied maakt observatie van de monster dynamiek in het verticale vlak mogelijk. De mogelijkheid om de temperatuur te reguleren met een silicone rubberen kachel maakt ook observatie van temperatuurafhankelijke monster gedragingen mogelijk. Bovendien worden de temperatuur gegevens overgebracht naar een Internet server. Temperatuurinstellingen en logboek bewaking kunnen op afstand vanaf een PC of smartphone worden bediend.
Introduction
Optische microscopie is een techniek gebruikt om observeerbare details te verhogen via vergroting van een monster met lenzen en zichtbaar licht. In optische microscopie wordt licht op een monster gericht, vervolgens overgebracht, gereflecteerd, of fluorescerende licht wordt opgevangen door vergrootglazen voor observatie. Er zijn verschillende soorten Microscoop beschikbaar die verschillen in ontwerp om tegemoet te komen aan verschillende toepassingen en observatie methoden. De verschillende ontwerpen omvatten een rechtopstaande Microscoop, die is gestructureerd om een monster van onder te verlichten voor observatie van bovenaf, en een omgekeerde Microscoop, die het monster van bovenaf verlicht voor observatie van onderen. Staande microscopen zijn het meest voorkomende en meest gebruikte ontwerp. Omgekeerde microscopen worden vaak gebruikt om monsters te observeren die een lens niet in de verte van bovenaf kunnen sluiten, zoals gekweekte cellen die zich aan de onderkant van een container hechten. Veel onderzoeksgroepen hebben waarnemingen gerapporteerd in een breed scala van velden met behulp van omgekeerde microscopen1,2,3,4,5,6,7. Veel extra apparaten zijn ook ontwikkeld die profiteren van de functies van omgekeerde microscopen8,9,10,11,12,13 .
Momenteel is de Microscoop fase in alle conventionele Microscoop ontwerpen horizontaal en ongeschikt voor het observeren van monsters die beweging in het verticale vlak produceren (door zwaartekracht, drijfvermogen, beweging, enz.). Om deze waarnemingen mogelijk te maken, moeten de Microscoop fase en het lichtpad worden gedraaid naar verticaal. De verticale trap is vereist voor het verticaal monteren van glaasjes of Monsterhouders zoals een Petri schaaltje op het podium. Om dit aan te pakken, is er al een zijwaartse omgekeerde Microscoop gekanteld met 90 ° bedacht. Het bevestigen van samples met tape of andere lijmen geeft echter niet de noodzakelijke langdurige immobiliteit. Hier beschreven is een apparaat dat de nodige stabiliteit kan bereiken. Dit apparaat maakt observatie mogelijk na verloop van tijd van de monster beweging in het verticale vlak. Het monteren van een siliconen rubberen kachel heeft het ook mogelijk gemaakt om de invloed van temperatuur variatie op het monster gedrag te observeren. Temperatuur gegevens worden via Wi-Fi overgebracht naar een Internet server en de temperatuurinstellingen en logboek bewaking kunnen op afstand vanaf een PC of smartphone worden bestuurd. Naar onze kennis is het podium bevestigd aan een zijwaartse gekantelde Microscoop, gekanteld met 90 °, nog niet gemeld in voorgaande studies.
De Microscoop fase bestaat uit drie aluminium platen. De middelste aluminium plaat is gemonteerd op de onderste aluminium plaat die aan het podium wordt bevestigd. Het Silicone rubber met de temperatuursensor is bevestigd tussen de middelste en bovenste aluminium platen. Elastiekjes worden gebruikt om het monster aan te brengen. De klauwen zijn links en rechts vier punten van de bovenste aluminium plaat bevestigd om de elastiekjes te beveiligen. Het controle circuit van de temperatuurregelaar ontvangt een signaal van de temperatuursensor ingebed in Silicone rubber en moduleert elektrische stroom door de Pulsbreedtemodulatie (PWM) methode. De temperatuur kan geleidelijk worden verhoogd tot 50 °C in stappen van 1 °C. Dit apparaat is handig voor toepassingen waarin verticale monster bewegingen afhankelijk van de temperatuur kunnen zijn.
Dit verslag geeft voorbeelden van temperatuureffecten op het drijvende fenomeen van diatomen. Als voorbeelden van diatoom observatiestudies werden metingen van sedimentatie snelheid van celclusters, bewegingsanalyses, ultrafijne structuur studies, etc. gerapporteerd14,15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. de soortelijke zwaarte van diatomen die in water met fotosynthetische organismen zweven, is iets hoger dan dat van water, zodat ze de neiging hebben om te zinken; ze zullen echter stijgen als er zelfs lichte convectie optreedt. Om dit fenomeen te bestuderen, wordt een glazen glijbaan verticaal op een Microscoop-fase aangebracht en worden de effecten van stijgende temperatuur op diatoom verticale beweging waargenomen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Traject analyse van bewegende diatoom cellen is een nuttige benadering voor het evalueren van de beweeglijkheid van de diatoom. Echter, terwijl een normale omgekeerde Microscoop monsters horizontaal observeert, is het niet geschikt voor observaties van de invloed van de zwaartekracht of zwevende beweging in de verticale richting. Hier ontwikkeld en beschreven is een verticale Microscoop fase met temperatuurregeling en bevestigd aan een omgekeerde Microscoop, die is geroteerd door 90 °. Deze Microscoop fase met temperatu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs hebben geen erkenningen.
Materials
| AC adapter 12V2A | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | AD-D120P200 | Tokyo, Japan |
| ADS1015 Substrate | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | adafruit PRODUCT ID: 1083 | Tokyo, Japan |
| Alminium Plate (Back Side Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 1.5mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Forefront Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 2mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 4mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 5mm | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution | Sigma-Aldrich Co. LLC | B5282-500ML | St. Louis, USA |
| Controller Case | Marutsu Elec Co., Ltd. | pff-13-3-9 | Tokyo, Japan |
| CPU | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | ESP-WROOM-02D | Tokyo, Japan |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | CKX 53 | Tokyo, Japan |
| Low temperature hardening epoxy resin adhesive | ThreeBond Co., Ltd. | TB2086M | Tokyo, Japan |
| Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | 3296W-1-501LF | Tokyo, Japan |
| OLED module | Akihabara Inc. | M096P4W | Tokyo, Japan |
| Pressed Cork (For supporting electrode ) | Tera Co., Ltd. | W 42mm×L 30㎜ | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Lower Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 0.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Upper Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Rotary encoder with switch with 2 color LED | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | P-05772 | Tokyo, Japan |
| Silicone rubber heater | Three High Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Kanagawa, Japan |
| Substrate | Seeed Technology Co., Ltd. | mh5.0 | Shenzhen, China |
| Temperature sensor | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | NXFT15XH103FA2B050 | Tokyo, Japan |
| Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V | Marutsu Elec Co., Ltd. | BR301 | Tokyo, Japan |
| Universal Flexible Arm | Banggood Technology Co., Ltd. | YP-003-2 | Hong Kong, China |
| USB cable USB-A – MicroUSB | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | USB CABLE A-MICROB | Tokyo, Japan |
| Video Canera | Sony Corporation | HDR-CX590 | Tokyo, Japan |
References
- Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
- McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
- Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
- Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
- Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM – selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
- Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
- Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
- Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
- Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
- Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
- Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
- Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
- Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
- Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
- Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields – A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
- Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
- Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
- Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
- Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates – potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
- Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
- Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion – An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).
