Summary

Fabricação do estágio do microscópio para a observação vertical com função de controle da temperatura

Published: July 31, 2019
doi:

Summary

É apresentado aqui um protocolo usando um estágio temperatura-controlado do microscópio que permita que um recipiente da amostra seja montado em um microscópio vertical.

Abstract

As amostras são coloc geralmente em um estágio horizontal do microscópio para a observação microscópica. No entanto, para observar a influência da gravidade em uma amostra ou no comportamento do estudo à tona, é necessário fazer o estágio do microscópio vertical. Para fazer isso, um microscópio invertido lateralmente inclinado por 90 ° foi planejado. Para observar amostras com este microscópio, os recipientes da amostra tais como placas de Petri ou as corrediças de vidro devem ser fixados ao estágio verticalmente. Um dispositivo que possa fixar recipientes da amostra no lugar em um estágio vertical do microscópio foi desenvolvido e é descrito aqui. O acessório deste dispositivo ao estágio permite a observação da dinâmica da amostra no plano vertical. A capacidade de regular a temperatura usando um aquecedor de borracha de silicone também permite a observação de comportamentos de amostra dependentes da temperatura. Além disso, os dados de temperatura são transferidos para um servidor de Internet. As configurações de temperatura e o monitoramento de logs podem ser controlados remotamente a partir de um PC ou smartphone.

Introduction

A microscopia óptica é uma técnica empregada para aumentar os detalhes observáveis através da ampliação de uma amostra com lentes e luz visível. Na microscopia óptica, a luz é direcionada para uma amostra, então transmitida, refletida, ou a luz fluorescente é capturada por lentes de ampliação para observação. Vários tipos de microscópio estão disponíveis que diferem no projeto para acomodar diferentes usos e métodos de observação. Os projetos diferentes incluem um microscópio ereto, que seja estruturado para iluminar uma amostra de abaixo para a observação de acima, e um microscópio invertido, que ilumine a amostra de acima para a observação de abaixo. Os microscópios eretos são o projeto o mais comum e o mais amplamente utilizado. Microscópios invertidos são freqüentemente usados para observar as amostras que não podem permitir uma lente perto da distância de cima, tais como células cultivadas aderente à parte inferior de um recipiente. Muitos grupos de pesquisa relataram observações em uma ampla gama de campos usando microscópios invertidos1,2,3,4,5,6,7. Muitos dispositivos adicionais também foram desenvolvidos que aproveitam as características dos microscópios invertidos8,9,10,11,12,13 .

Atualmente, em todos os projetos convencionais do microscópio, o estágio do microscópio é horizontal e é conseqüentemente inadequado para a observação das amostras produzindo o movimento no plano vertical, (devido à gravidade, à flutuabilidade, ao movimento, etc.). Para fazer estas observações possíveis, o estágio do microscópio e o trajeto claro devem ser girados para vertical. O estágio vertical é exigido para montar verticalmente corrediças de vidro ou recipientes da amostra tais como pratos de Petri ao estágio. Para abordar isso, um microscópio invertido lateralmente inclinado por 90 ° já foi planejado. No entanto, a fixação de amostras com fita adesiva ou outros adesivos não produz a imobilidade de longo prazo necessária. Descrito aqui é um dispositivo que pode alcançar a estabilidade necessária. Este dispositivo permite a observação sobre o tempo do movimento da amostra no plano vertical. A montagem de um calefator de borracha do silicone igualmente fêz possível observar a influência da variação da temperatura no comportamento da amostra. Os dados de temperatura são transferidos para um servidor de Internet por Wi-Fi, e as configurações de temperatura e monitoramento de log podem ser controlados remotamente a partir de um PC ou smartphone. A nosso conhecimento, o estágio Unido a um microscópio inclinado lateralmente inclinado por 90 ° não foi relatado ainda em estudos precedentes.

O estágio do microscópio é compor de três placas de alumínio. A placa de alumínio médio é montada à placa de alumínio mais baixa que atribui ao estágio. A borracha de silicone que contem o sensor de temperatura é unida entre as placas de alumínio médias e superiores. As bandas de borracha são usadas para afixar a amostra. As garras são anexadas na esquerda e direita quatro pontos da placa de alumínio superior para fixar as bandas de borracha. O circuito de controle do regulador de temperatura recebe um sinal do sensor de temperatura incorporado na borracha de silicone e modula a energia elétrica pelo método da modulação da largura de pulso (PWM). A temperatura pode gradualmente ser aumentada a 50 ° c em incrementos de 1 ° c. Este dispositivo é útil para as aplicações em que os movimentos verticais da amostra podem ser temperatura-dependentes.

Este relatório fornece exemplos de efeitos de temperatura sobre o fenômeno flutuante de diatomáceas. Como exemplos de estudos de observação de diatomáceas, medidas de velocidade de sedimentação de aglomerados celulares, análises de movimento, estudos de estrutura Ultrafina, etc. foram relatados14,15,16,17 , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , a gravidade 23. The específica dos diatomáceas que flutuam na água com organismos fotossintética é ligeiramente mais elevada do que aquela da água, assim que tendem a afundar-se; Entretanto, levantarão se mesmo a convecção ligeira está ocorrendo. Para estudar este fenômeno, uma corrediça de vidro é afixada verticalmente a um estágio do microscópio, e os efeitos da temperatura crescente no movimento vertical do diatomáceas são observados.

Protocol

1. projeto Fabricação de chapas de alumínio Corte um furo de 101 mm no centro de uma placa de alumínio de dimensões 150 mm x 200 mm x 2 mm para ser usado como a placa de vanguarda com uma máquina de processamento a laser. Garras da máquina em oito pontos para afixar duas faixas de borracha através do comprimento, ou dois através da largura desta placa (veja Figura suplementar 1a e Figura suplementar 2a). Corte um furo de 130 milímetros no centro de …

Representative Results

A Figura 2 mostra a distribuição da temperatura do aquecedor de borracha. A temperatura de superfície do calefator de borracha era uniforme em cada temperatura. A Figura 3 mostra a capacidade de resposta da temperatura medida para ajustar as mudanças de temperatura. A linha laranja mostra a temperatura definida e a linha azul mostra a mudança da temperatura da amostra. O overshoot do valor medido à mudança da configuraçã…

Discussion

A análise da trajetória de células de diatomáceas móveis é uma abordagem útil para avaliar a motilidade da diatomácea. Entretanto, quando um microscópio invertido normal observar amostras horizontalmente, não é apropriado para observações da influência da gravidade ou do movimento de flutuação na direção vertical. Desenvolvido e descrito aqui é um estágio de microscópio vertical com controle de temperatura e anexado a um microscópio invertido, que foi girado por 90 °. Este estágio do microscópio …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores não têm agradecimentos.

Materials

AC adapter 12V2A Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. AD-D120P200 Tokyo, Japan
ADS1015 Substrate Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. adafruit PRODUCT ID: 1083 Tokyo, Japan
Alminium Plate (Back Side Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200㎜×T 1.5mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Forefront Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200㎜×T 2mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Lower Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200㎜×T 4mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Upper Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200㎜×T 5mm Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Lower Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Upper Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution Sigma-Aldrich Co. LLC B5282-500ML St. Louis, USA
Controller Case Marutsu Elec Co., Ltd. pff-13-3-9 Tokyo, Japan
CPU Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. ESP-WROOM-02D Tokyo, Japan
Inverted microscope Olympus Corporation CKX 53 Tokyo, Japan
Low temperature hardening epoxy resin adhesive ThreeBond Co., Ltd. TB2086M Tokyo, Japan
Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. 3296W-1-501LF Tokyo, Japan
OLED module Akihabara Inc. M096P4W Tokyo, Japan
Pressed Cork (For supporting electrode ) Tera Co., Ltd. W 42mm×L 30㎜ Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Lower Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 0.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Upper Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Rotary encoder with switch with 2 color LED Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. P-05772 Tokyo, Japan
Silicone rubber heater Three High Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Kanagawa, Japan
Substrate Seeed Technology Co., Ltd. mh5.0 Shenzhen, China
Temperature sensor Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. NXFT15XH103FA2B050 Tokyo, Japan
Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V Marutsu Elec Co., Ltd. BR301 Tokyo, Japan
Universal Flexible Arm Banggood Technology Co., Ltd. YP-003-2 Hong Kong, China
USB cable USB-A – MicroUSB Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. USB CABLE A-MICROB Tokyo, Japan
Video Canera Sony Corporation HDR-CX590 Tokyo, Japan

References

  1. Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
  2. McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
  3. Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
  4. Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
  5. Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
  6. Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
  7. Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM – selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
  8. Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
  9. Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
  10. Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
  11. Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
  12. Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
  13. Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
  14. Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
  15. Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
  16. Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
  17. Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields – A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
  18. Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
  19. Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
  20. Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
  21. Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates – potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
  22. Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
  23. Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion – An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).

Play Video

Cite This Article
Matsukawa, Y., Ide, Y., Umemura, K. Fabrication of Microscope Stage for Vertical Observation with Temperature Control Function. J. Vis. Exp. (149), e59799, doi:10.3791/59799 (2019).

View Video