تصنيع مرحلة المجهر للمراقبة الرأسية مع وظيفة التحكم في درجة الحرارة
Summary
يعرض هنا بروتوكول باستخدام مرحلة المجهر التي تسيطر عليها درجة الحرارة التي تسمح حاوية عينة ليتم تركيبها على المجهر الرأسي.
Abstract
وعادة ما توضع العينات على مرحلة المجهر الأفقي للمراقبة المجهرية. ومع ذلك، لمراقبة تأثير الجاذبية على عينة أو دراسة السلوك العائم، فمن الضروري لجعل مرحلة المجهر عمودي. ولتحقيق ذلك، تم تصميم مجهر مقلوب جانبية يميل بنسبة 90 درجة. لمراقبة العينات مع هذا المجهر، يجب تأمين حاويات عينة مثل أطباق بيتري أو الشرائح الزجاجية إلى المرحلة عموديا. وقد تم تطوير جهاز يمكن تأمين حاويات العينة في مكان على مرحلة المجهر الرأسي ويرد وصفه هنا. مرفق هذا الجهاز إلى المرحلة يسمح مراقبة ديناميات عينة في المستوى الرأسي. القدرة على تنظيم درجة الحرارة باستخدام سخان مطاط السيليكون يسمح أيضا مراقبة السلوكيات عينة تعتمد على درجة الحرارة. وعلاوة على ذلك، يتم نقل بيانات درجة الحرارة إلى خادم إنترنت. يمكن التحكم في إعدادات درجة الحرارة ومراقبة السجل عن بعد من جهاز كمبيوتر أو هاتف ذكي.
Introduction
الفحص المجهري البصري هو تقنية تستخدم لزيادة التفاصيل التي يمكن ملاحظتها عن طريق تكبير عينة مع العدسات والضوء المرئي. في الفحص المجهري البصري، يتم توجيه الضوء إلى عينة، ثم يتم نقلها، أو عكسها، أو يتم التقاط ضوء الفلورسنت بواسطة عدسات مكبرة للمراقبة. تتوفر أنواع مختلفة من المجهر التي تختلف في التصميم لاستيعاب الاستخدامات المختلفة وطرق المراقبة. وتشمل التصاميم المختلفة مجهر تستقيم، والتي تم تنظيمها لإلقاء الضوء على عينة من أدناه للمراقبة من فوق، ومجهر مقلوب، الذي يضيء العينة من فوق للمراقبة من أدناه. المجاهر تستقيم هي التصميم الأكثر شيوعا والمستخدمة على نطاق واسع. غالبًا ما تستخدم المجاهر المقلوبة لمراقبة العينات التي لا تسمح بقفل العدسة عن بعد من الأعلى، مثل الخلايا المستزرعة الملتصقة بأسفل الحاوية. وقد أبلغت العديد من مجموعات البحوث ملاحظات في مجموعةواسعة من المجالات باستخدام المجاهر المقلوبة 1،2،3،4،5،6،7. كما تم تطوير العديد من الأجهزة الإضافية التي تستفيدمن ملامح المجاهر المقلوبة 8،9،10،11،12،13 .
حاليا، في جميع التصاميم المجهر التقليدية، مرحلة المجهر أفقي، وبالتالي غير مناسبة لمراقبة العينات المنتجة الحركة في المستوى الرأسي، (بسبب الجاذبية، الطفو، الحركة، الخ). لجعل هذه الملاحظات ممكنة، يجب أن يتم تدوير مرحلة المجهر ومسار الضوء إلى عمودي. المرحلة الرأسية مطلوبة لتركيب عموديا الشرائح الزجاجية أو حاويات عينة مثل أطباق بيتري إلى المرحلة. ولمعالجة هذا الأمر، تم بالفعل وضع مجهر مقلوب جانبي يميل إلى 90 درجة. ومع ذلك، إرفاق عينات مع الشريط أو غيرها من المواد اللاصقة لا تسفر عن الجمود على المدى الطويل اللازمة. وصف هنا هو الجهاز الذي يمكن تحقيق الاستقرار اللازم. يسمح هذا الجهاز بالمراقبة مع مرور الوقت لحركة العينة في المستوى الرأسي. كما جعل تركيب سخان المطاط السيليكون من الممكن لمراقبة تأثير التباين في درجة الحرارة على سلوك العينة. يتم نقل بيانات درجة الحرارة إلى خادم الإنترنت عن طريق واي فاي، ويمكن التحكم في إعدادات درجة الحرارة ومراقبة السجل عن بعد من جهاز كمبيوتر أو هاتف ذكي. على حد علمنا، لم يتم الإبلاغ عن المرحلة المرفقة بمجهر مائل جانبية يميل بنسبة 90 درجة في الدراسات السابقة.
وتتكون مرحلة المجهر من ثلاث لوحات الألومنيوم. يتم تركيب لوحة الألومنيوم الأوسط إلى لوحة الألومنيوم السفلي التي تعلق على المرحلة. يتم إرفاق المطاط سيليكون التي تحتوي على جهاز استشعار درجة الحرارة بين لوحات الألومنيوم الأوسط والعلوي. وتستخدم العصابات المطاطية لتثبيت العينة. يتم إرفاق مخالب في اليسار واليمين أربع نقاط من لوحة الألومنيوم العلوي لتأمين العصابات المطاطية. تتلقى دائرة التحكم في منظم درجة الحرارة إشارة من مستشعر درجة الحرارة المدمج في مطاط السيليكون وتعدل الطاقة الكهربائية بواسطة طريقة تعديل عرض النبض (PWM). يمكن زيادة درجة الحرارة تدريجيا إلى 50 درجة مئوية في 1 زيادات مئوية. هذا الجهاز مفيد للتطبيقات التي قد تكون حركات العينة العمودية تعتمد على درجة الحرارة.
ويقدم هذا التقرير أمثلة على آثار درجة الحرارة على الظاهرة العائمة المتمثلة في الدياتومات. وكأمثلة على دراسات رصد دياتوم، أُبلغ عن قياسات لسرعة ترسب مجموعات الخلايا، وتحليلات الحركة، ودراسات الهيكل فائقة الدقة، وما إلى ذلك،14و15و16و17 , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21 , 22 , 23– والجاذبية المحددة للدياتومات العائمة في الماء مع الكائنات الاصطناعية الضوئية أعلى قليلا من جاذبية المياه، ولذلك فإنها تميل إلى الغرق؛ ومع ذلك، فإنها سوف ترتفع إذا كان حتى الحمل الحراري طفيف يحدث. لدراسة هذه الظاهرة ، يتم تثبيت شريحة زجاجية عموديا على مرحلة المجهر ، ويلاحظ آثار زيادة درجة الحرارة على الحركة الرأسية دياتوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل مسار خلايا دياتوم المتحركة هو نهج مفيد لتقييم حركية الدياتوم. ومع ذلك، في حين أن المجهر المقلوب العادي يراقب العينات أفقيا، فإنه ليس مناسبا لرصد تأثير الجاذبية أو الحركة العائمة في الاتجاه الرأسي. وضعت ووصفت هنا هو مرحلة المجهر الرأسي مع التحكم في درجة الحرارة وتعلق على المجهر المق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وليس لدى أصحاب البلاغ أي اعتراف.
Materials
| AC adapter 12V2A | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | AD-D120P200 | Tokyo, Japan |
| ADS1015 Substrate | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | adafruit PRODUCT ID: 1083 | Tokyo, Japan |
| Alminium Plate (Back Side Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 1.5mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Forefront Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 2mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 4mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200㎜×T 5mm | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution | Sigma-Aldrich Co. LLC | B5282-500ML | St. Louis, USA |
| Controller Case | Marutsu Elec Co., Ltd. | pff-13-3-9 | Tokyo, Japan |
| CPU | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | ESP-WROOM-02D | Tokyo, Japan |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | CKX 53 | Tokyo, Japan |
| Low temperature hardening epoxy resin adhesive | ThreeBond Co., Ltd. | TB2086M | Tokyo, Japan |
| Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | 3296W-1-501LF | Tokyo, Japan |
| OLED module | Akihabara Inc. | M096P4W | Tokyo, Japan |
| Pressed Cork (For supporting electrode ) | Tera Co., Ltd. | W 42mm×L 30㎜ | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Lower Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 0.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Upper Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Rotary encoder with switch with 2 color LED | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | P-05772 | Tokyo, Japan |
| Silicone rubber heater | Three High Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Kanagawa, Japan |
| Substrate | Seeed Technology Co., Ltd. | mh5.0 | Shenzhen, China |
| Temperature sensor | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | NXFT15XH103FA2B050 | Tokyo, Japan |
| Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V | Marutsu Elec Co., Ltd. | BR301 | Tokyo, Japan |
| Universal Flexible Arm | Banggood Technology Co., Ltd. | YP-003-2 | Hong Kong, China |
| USB cable USB-A – MicroUSB | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | USB CABLE A-MICROB | Tokyo, Japan |
| Video Canera | Sony Corporation | HDR-CX590 | Tokyo, Japan |
References
- Drum, R. W. Electron Microscope Observations of Diatos. Osterreichische Botanische Zeitschrift. 116, 321 (1969).
- McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
- Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
- Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
- Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM – selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
- Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
- Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
- Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
- Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
- Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
- Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
- Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
- Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
- Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
- Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields – A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
- Iwasa, K., Shimizu, A. Motility of Diatom, Phaeodactylum-Tricornutum. Experimental Cell Research. 74, (1972).
- Edgar, L. A. Mucilage Secretions of Moving Diatoms. Protoplasma. 118, 44-48 (1983).
- Edgar, L. A. Diatom Locomotion. Computer-Assisted Analysis of Cine Film British Phycological Journal. 14, 83-101 (1979).
- Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates – potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
- Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
- Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion – An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).
