JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי

Published: July 06, 2019
doi:
10.3791/59722
, ,
1Macromolecular Crystallography (HZB-MX),Helmholtz-Zentrum Berlin, 2Department Sample Environment,Helmholtz-Zentrum Berlin

Summary

מחזיק לדוגמה הרומן לקריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן יחד עם פרוטוקול טיפול מתאים מוצג. המערכת מאפשרת צמיחה גביש, הטבילה גביש באוסף נתונים עקיפה באתרו בשניהם, הסביבה ואת הטמפרטורה הקריוגני ללא צורך של כל מניפולציה גביש או הרכבה.

Abstract

קריסטלוגרפיה באמצעות Macromolecular X-ray (MX) היא השיטה הבולטת ביותר להשגת ידע תלת מימדי ברזולוציה גבוהה של קרו ביולוגי. תנאי מוקדם לשיטה הוא כי הדגימה הגבישית המסודרת צריך לגדול ממקרומולקולה ללמוד, אשר לאחר מכן צריך להיות מוכן לניסוי עקיפה. הליך ההכנה הזה כרוך בדרך כלל בהסרת הגביש מהפתרון, בו הוא גדל, מספוג את הגביש בתמיסת התמיסה או הגנה על החומרים ולאחר מכן משתק את הגביש על הר המתאים לניסוי. בעיה רצינית לנוהל זה היא שקריסטלים macromolecular מאוד לא יציבים ושבריריים למדי. כתוצאה מכך, הטיפול בקריסטלים כה שבריריים יכול להפוך בקלות לצוואר בקבוק בניסיון לקביעת מבנה. כל כוח מכני המוחל על גבישים עדינים כאלה עלול להפריע לאריזת המולקולות הרגילה ועלול לגרום לאובדן כוח עקיפה של הקריסטלים. כאן, אנו מציגים מחזיק מדגם כל אחד ב-one, אשר פותחה על מנת למזער את צעדי הטיפול של קריסטלים ומכאן כדי למקסם את שיעור ההצלחה של הניסוי בקביעת המבנה. המחזיק לדוגמה תומך ההתקנה של טיפות קריסטל על ידי החלפת מיקרוסקופ בשימוש נפוץ לכסות תעודות. יתר על כן, הוא מאפשר מניפולציה גבישים במקום כגון ליגיום, הגנה ההקפאה והיווצרות מורכבים ללא כל פתיחה של חלל התגבשות וללא טיפול בקריסטלים. לבסוף, מחזיק המדגם תוכנן על מנת לאפשר את האוסף של נתוני עקיפה באתרו של קרני רנטגן בשני הצדדים, טמפרטורת הסביבה והקריוגניים. באמצעות מחזיק מדגם זה, הסיכוי לפגוע בגביש בדרכו מהתגבשות לאיסוף נתונים עקיפה מופחת במידה ניכרת מאז טיפול בגביש ישיר אינו נדרש עוד.

Introduction

הידע של המבנה התלת-מימדי של הקרו הביולוגי מהווה אבן פינה חשובה בכל המחקרים הביולוגיים, הביוכימיים והביו-רפואיים הבסיסיים. זה אפילו משתרע על היבטים טרנסלבותית מסוימים של מחקר כזה, כמו למשל גילוי סמים. בין כל השיטות להשגת מידע תלת-מימדי כזה בקריסטלוגרפיה באמצעות רנטגן ברזולוציה אטומית הוא החזק ביותר והבולט ביותר כפי שמעידים העובדה כי 90% מהמידע המבני הזמין נתרם על-ידי רנטגן קריסטלוגרפיה1. הדרישה העיקרית של קריסטלוגרפיה רנטגן, אשר באותו זמן המגבלה העיקרית שלה, היא כי קריסטלים באיכות עקיפה צריך להיות מיוצר ומוכן לניסוי עקיפה. שלב זה עדיין מהווה את אחד מצווארי הקבוק העיקריים של השיטה.

מבחינה היסטורית, נתוני עקיפה מגבישי החלבון נאספו בטמפרטורת הסביבה. גבישים בודדים הועברו בקפידה לתוך נימים זכוכית או קוורץ לפני איסוף הנתונים, אמא משקאות התווסף נימים כך הקריסטלים לא להתייבש ואת נימים היו חתומים2,3, ד. מאז שנות ה-80, זה נעשה יותר ויותר ברור כי בשל תכונות מייננת של קרינת X ורגישות הקרינה הקרובה של קריסטלים macromolecular, איסוף נתונים בטמפרטורת הסביבה מהווה הגבלות חמורות על השיטה. אפוא, גישות פותחו כדי להקל על השפעות נזק לקרינה על ידי קירור macromolecular קריסטלים למטה כדי 100 K ולאסוף נתונים עקיפה בטמפרטורה נמוכה כזאת5,6. עבור עבודה בטמפרטורות נמוכות, ההרכבה של דגימות בנימים הפך מעשי בשל שיעור נמוך של העברת חום. למרות זאת, ישנם מאמצים שוטפים גם להשתמש נימים, במיוחד מפני ניסויים התגבשות נגד דיפוזיה, עבור עבודה עקיפה בטמפרטורה נמוכה7,8, אבל, בלי קשר לזה, זה הפך להיות סטנדרטי גישה ב macromolecular קריסטלוגרפיה להר macromolecular קריסטלים שהוחזקו על ידי סרט דק של ליקר אמא בתוך לולאה קווית דק9,10. למרות שכמה שיפורים (למשל, הקדמה של ליטוגרפיה ומבנים דומים11) נעשו לאורך זמן להרכבה זו מבוססת לולאה, העקרונות הבסיסיים שפותחו בתחילת שנות ה-90 עדיין בשימוש היום. זה יכול להיות בטוח כי אוספי נתונים עקיפה ביותר על קריסטלים macromolecular כיום עדיין להסתמך על גישה זו5.

במשך הזמן, היו כמה התפתחויות חדשות מעניינות ושינויים של שיטת הרכבה מבוססת לולאה, אבל גישות אלה עד כה לא היו מאומצים באופן נרחב בקהילה. האחד הוא ההרכבה הפחות לולאה של קריסטלים, שפותחה כדי להשיג את פיזור הרקע התחתון12,13,14. עוד אחד הוא השימוש בנרתיקים גראפן כדי לעטוף את דגימות גבישי כדי להגן עליהם מפני ייבוש. גראפן הוא חומר מתאים היטב בהקשר זה בגלל שלה נמוך מאוד קרני רנטגן הרקע שלה15.

לאחרונה, התפתחויות בתחום של מדגם טעינות התמקדו בעיקר בסטנדרטיזציה של הטעינות במטרה להגדיל את תפוקת המדגם16 או על עיצוב טעינות, אשר יכול להכיל יותר ממדגם אחד17, כגון למשל ממברנות על מסגרת סיליקון, אשר מסוגלים להחזיק מאות קריסטלים קטנים בעיקר בתחום של קריסטלוגרפיה טורית18,19,20,21,22.

כל שיטות ההרכבה לדוגמה שנדונו עד כה דורשות מידה מסוימת של התערבות ידנית, כלומר יש סכנה הטבועה בגרימת נזק מכני למדגם. לכן, גישות הרומן מבוקשים על ידי הנדסה הסביבה לדוגמה, כך הנתונים עקיפה של גבישים ניתן לאסוף בתוך סביבת הצמיחה שלהם. אחת שיטה כזאת נקראת באתרו או צלחת-הקרנה23,24 וזה כבר מיושם במספר macromolecular קריסטלוגרפיה beamlines במקורות סינכרוטרון שונים ברחבי העולם25. עם זאת, השימוש בשיטה זו מוגבל על-ידי הפרמטרים הגיאומטריים של צלחת הקריסטל והמרחב הזמין סביב נקודת הדגימה של המכשיר.

עוד גישה ממומשת במערכת CrystalDirect26. כאן, טיפות התגבשות שלמות נקצרו באופן אוטומטי. הרחפות שעליהן גדלו הקריסטלים מותאמות אישית באמצעות לייזר ומשמשות ישירות כמחזיק הדגימה27.

בעבודה המתוארת כאן, המטרה הייתה לפתח מחזיק מדגם, שיאפשר למשתמש להעביר את הדגימה הגבישית מחדר הצמיחה שלו אל התקן איסוף הנתונים מבלי לגעת בו ושיאפשר למשתמש לטפל במדגם בקלות. מאז חוקרים רבים בתחום של קריסטלוגרפיה macromolecular עדיין משתמש בפורמט 24-התגבשות היטב עבור אופטימיזציה של צמיחה קריסטל על ידי שינוי התנאים שזוהו בקמפיינים הקרנה גדול, המחזיק המדגם החדש נועד להיות תואם לתבנית זו. בדוגמה הבאה, העיצוב של בעל המדגם החדש יתואר ואת הטיפול ואת הביצועים של מחזיק המדגם עבור איסוף נתונים באתרו ו ליגיום הטבילה יווכחו. לבסוף, ההתאמה של מחזיק מדגם חדש, כמו גם מגבלותיו עבור שלבי העבודה השונים יידונו.

Protocol

התראה: בכל העבודה הבאה, חשוב מאוד שרדיד האלומיניום של הצבע הצהוב לא יגע באצבעות לא מוגנים, בגלל שזהום אפשריים למחזיק הדגימה. כמו כן, השימוש של מלקחיים מוגנים מומלץ מאוד. 1. מחזיק הדגימה השתמש באחד משלושת הסוגים של מחזיק המדגם.הערה: שלוש גרסאות שונות של מחזיק המדגם החדש מוצגות באיור 1. כולם מכילים מבנה תמיכה פלסטיק שחור, coc אטום רדיד אלומיניום על החלק החיצוני, מיקרופור מובנית פוליאימיד רדיד אלומיניום בפנים. סוג 1 (איור 1A) מכיל טבעת פלסטיק חיצונית קבועה, ואילו עבור סוגים 2 ו-3 (איור 1a,1a) את הטבעת החיצונית ניתן לשבור את מכנית על נקודות הפסקה המתאימות לשימוש במערכות העברה לדוגמה אוטומטית (ראה אדום חיצים באיור 1B). העיצוב של מחזיקי מדגם מאפשר התקנה של טיפות התגבשות מרובות על רדיד האלומיניום הצהוב. היא אינה מסכנת את הניטור של ניסוי התגבשות, מכיוון שהחומר שקוף מאוד לאור נראה. The 21 יקרומטר עבה פוליאימיד רדיד אלומיניום גם תכונות 5 יקרומטר נקבוביות, אשר מאפשר מניפולציה קריסטל פשוטה על ידי הטבילה מאוחר יותר. מאז השידור של קרני רנטגן קרוב ל 1.0 בכל האנרגיה הנפוצה לאיסוף נתונים באמצעות macromolecular קריסטלוגרפיה, תרומת רדיד הנייר לפיזור הרקע בניסוי עקיפה הוא זניח28. 2. הגדרת טיפות התגבשות צור משטח נקי ונטול אבק בעזרת מטלית נטולת מוך. קח מחזיק דוגמה אחד מהקופסה שלו ובעדינות למקם אותו, רדיד צהוב כלפי מעלה, על משטח נקי כדי למנוע נזק או ניקוב לא רצוי של רדיד COC האחורי. הגדרת טיפות התגבשות עם נפח מומלץ מרבי של 2 μL על רדיד האלומיניום הצהוב כפי שהוא ייעשה על שקופיות כיסוי נפוץ. מניחים את הטיפות בעדינות כדי למנוע קרע או פירסינג של רדיד האלומיניום באמצעות פיפטה. על מחזיק מדגם מסוג 1 (איור 2A) עד שלוש טיפות ניתן להציב, ואילו על בעלי מדגם מסוג 2 ו 3 2 טיפות הם המקסימום המומלץ (איור 2a). הפוך את מחזיק המדגם מעל ומניחים אותו על חלל מראש משומן של צלחת לינברו בסגנון 24. השתמש בעזרי המיקום (ראה חיצים אדומים באיור 1 א) של מחזיק הדגימה כדי להנחות אותו למיקומו האופטימלי. להבטיח את המיקום הנכון של מחזיק המדגם כדי למנוע אידוי לא רצוי (איור 2A). 3. התבוננות בצמיחת הגביש על ידי הצבת לוחית התגבשות תחת מיקרוסקופ אור שידור, עם או בלי מקטרנים, לנטר את צמיחת הגביש ללא כל הפרעה של הניסוי (איור 4). בעת שימוש קטן יותר 18-mm בעלי המדגם של סוג 3 (איור 1C), אשר עוצבו לשימוש על לוחות הרגל sbs, להשתמש רובוט הדמיה מסוגל לטפל לוחות השטח sbs לפקח על צמיחת הגביש באופן אוטומטי יותר. 4. מניפולציה גבישית הערה: מומלץ לבצע את כל השלבים הבאים תחת מיקרוסקופ אור שידור. הגנה מפני הקפאה נקב בעדינות את רדיד ה-COC החיצוני בעזרת צינורית עדינה. ודא שנייר הכסף הצהוב הפנימי נשאר ללא שינוי. הניקוב צריך להיות ממש ליד הירידה כי הוא להיות מניפולציות (איור 3A,3a). השתמש בפתיל נייר משובח והכנס אותו לתוך החור. דחפו בזהירות את הפתיל קדימה עד שהוא נוגע ברדיד האלומיניום הצהוב. שמור את הפתיל במגע עם רדיד מחורר. הפתיל יהיה לשאוב את כל הפתרון העודף. הזמן הנדרש להסרת נוזלים מלאה תלוי בצמיגות של הפתרונות והרכב האם משקאות (איור 3B). אחרי כל נוזל נשאב החוצה, בעדינות לבטל את הפתיל נייר. זכור את המיקום של הירידה, מאז זה לא יכול להיות גלוי לאחר הסרת משקה האם. קח את הצנרת הסטנדרטית כדי למרוח. כמות קטנה של תמיסה להגנה על המקפיא, מקס 3 μL, שימוש בקצה משתנה (לדוגמה, עצה לטעינת ג’ל) דרך אותו חור. , ברגע שהנוזל מושם. משכי את הקצה החלק של הרדיד הצהוב מאפשר דיפוזיה על פני נייר הכסף. הזמן להשיג הגנה על הקריסטלים מאוד תלוי בפתרון המועסקים וברכיביו. כדי לחתום מאטום את רדיד ה-COC של הריפוי העצמי, הנח בעדינות אצבע מוגנת על החור בערך 1 והחלק אותו לאורך הניקוב. הלחץ הקל בשילוב עם הטמפרטורה הגבוהה יקדם את האטימות של דקירות, שאינן גדולות מדי. ליגאטהערה: עודף אמא משקה ניתן להסיר לפני הטבילה. לשם כך, בצע את השלבים המתוארים ב-4.1.1 to 4.1.3. מתמוסס את הליטר לאם ליקר בריכוז הרצוי בצינור התגובה. ספין הפתרון עבור 10 דקות על 12,000 x g על מנת להסיר חלקיקים מסיסים. במידת הצורך, השתמש בצנטריפוגה מבוקרת טמפרטורה. הנח בעדינות נפח של מקסימום. 3 μl של ליגנד המכיל פתרון בפער בין רדיד coc לבין הסרט פוליאימיד באמצעות טיפ ארוך, הבלטת מחמד. . משכי את הקצה כדי לחתום מאטום את רדיד ה-COC של הריפוי העצמי, הנח בעדינות אצבע מוגנת על החור בערך 1 והחלק אותו על-פני הניקוב (ראה גם 4.1.5). מודדת את הניסוי לזמן מה כדי לאפשר דיפוזיה על פני הקרום. זמן הטבילה תלוי בצמיגות של פתרון הפיזור וברכיביו29. חזור על שלבים ה4.2.1 ל4.2.5 מספר פעמים כדי לטבול לאחר מכן בליחים שונים. 5. איסוף נתונים עקיפה באתרו בטמפרטורת הסביבה הערה: כדי למזער את פיזור הממס, הסר את הפתרון העודף לפני איסוף הנתונים. להבטיח לחות יציבה מבוקרת בסביבת beamline עם תנאים מראש נקבע30. הרם בעדינות את רדיד ה-COC השקוף בנקודה המיועדת באמצעות מלקחיים וקלף אותו כאילו אחד יסיר את המכסה מספל יוגורט ( איור 6B). הרימו בעדינות את מחזיק המדגם מחלל הריק שלו והכניסו אותו מיד לבסיס מגנטי מוכן מראש לדוגמה. אין צורך בהדבקה בשלב זה (איור 6B). החל לחץ עדין כדי להבטיח את המיקום הנכון של מחזיק המדגם בתוך הבסיס. הר את מחזיק המדגם על מדידת מד זווית ולהבטיח מיקום נכון של המחזיק. בהתאם לגיאומטריה מד זווית מחזיק המדגם יכול להיות מסובב על ידי עד 160 ° ללא גרימת הצללה במהלך ניסוי עקיפה. השתמש פתיל נייר ולגעת בעדינות פוליאימיד רדיד צהובה מאחור כדי להסיר משקה אם עודף. הינכם מתבקשים לשים לב כי בשלב זה, ליגולי הטבילה או הגנת ההקפאה ניתן לבצע בדיוק. המדגם מוכן כעת עבור איסוף נתונים של מרכוז ועקיפה. בשעת שימוש במחזיק מדגם עם טבעת חיצונית נשלפת, הפעילו לחץ עדין על ידי החזקת הטבעת החיצונית ושוברים אותו בנקודות ההפסקה המיועדות (איור 6C). המדגם מוכן כעת עבור איסוף נתונים של מרכוז ועקיפה. 6. באיסוף נתונים עקיפה באתרו בטמפרטורת הקריוגניים הערה: מומלץ להסיר שאריות משקאות אם מהמדגם על ידי ביצוע השלבים 4.1.1. ל4.1.3 לפני שתמשיך בשלבים הבאים כדי למזער את פיזור הממס. רוב הדגימות עשויים להיות מועברים לחנקן נוזלי ללא הגנה מוקדמת31. אם יש צורך בהגנה על ההקפאה, ראה צעדים 4.1.1. ל4.1.5 הרם בעדינות את רדיד ה-COC בנקודה המיועדת באמצעות מלקחיים וקלף אותו (ראה שלב 5.1.2) (איור 6A). קח את מחזיק הדגימה מהחלל והבהר אותו על בסיס מדגם מגנטי. ניתן להחיל לחץ עדין על מנת להבטיח התאמה נכונה והדוקה (ראה שלב 5.1.5, איור 6B).הערה: נקודות ההפסקה המיועדות באופן סימטרי מאפשרות הסרה פשוטה של הטבעת החיצונית של מחזיק המדגם על-ידי החלת לחץ עדין (ראה שלב 5.1.8., איור 6C). עכשיו, המחזיק דגימה מוכן יכול להיות צלל לתוך חנקן נוזלי. הגיאומטריה של המחזיק לדוגמה סוגים 2 ו-3 (איור 1B,1b) מאפשר העברה לתוך מבחנות סטנדרטי לדוגמה עמוד השדרה, אשר ניתן להשתמש עבור רובוט בסיוע הרכבה לדוגמה (איור 6d).

Representative Results

סוג המחזיק לדוגמה 1 תוכנן כך שהוא יתאים לבאר של לוח בסגנון לינברו באורך 24 שעות. כל מחזיק לדוגמה מכיל עזרי מיצוב משני צדי השפה החיצונית כדי להבטיח מיקום אופטימלי על שפת הבאר (איור 1a, איור 2a). עד שלושה טיפות התגבשות בודדות של נפח מירבי 2 μL כל ניתן למקם על הנייר הצהוב הפולני (איור 2B). עבור מחזיקי לדוגמה של סוגים 2 ו-3, מומלץ להגדיר מקסימום 2 טיפות של נפח מירבי 2 μL כל. 24 מחזיקי מדגם ניתן להתאים על 1 24-היטב לינברו צלחת (איור 3D). ניסוי התגבשות על צלחת לינברו באורך 24 שעות, באמצעות סוג מחזיק המדגם 1 הוגדר. 1 μl של תרנגולת ביצה-לבן הפתרון ליזוזים (15 מ”ג/mL) היה מעורבב עם 1 μl של אמא-משקה המורכב 50 mM naac pH 4.7, 500 mm הנאקל ו -25% (w/v) יתד-6000 על רדיד האלומיניום הצהוב על מחזיק המדגם (שולחן 1). הירידה היתה מעורפלת ב 293 K נגד 500 μl של אמא ליקר וקריסטלים של גודל 40-50 יקרומטר נצפו לאחר 5 שעות (איור 4). ניתן לצפות בגידול בגביש בעזרת מיקרוסקופ אור שידור (איור 4) עם או בלי מקטצר. סרטים שקפים גבוהים להבטיח התבוננות וניטור הטוב ביותר של התנאים הגדלים גביש באמצעות שני, מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי או מערכת הדמיה אוטומטית של גביש. התבוננות בצמיחה קריסטל באמצעות UV-אור לא נבדקה. לאחר הסרת משקה האם מסביב הקריסטלים, מחזיק לדוגמה עם גבישים ביצה לבנה-לבן ליתיום היתה נלקחה מלוחית התגבשות והניח בזרם אוויר מבוקר לחות על HZB-MX beamline 14.332. נתוני עקיפה נאספו בטמפרטורת הסביבה בהפרשים של 1 ° באמצעות קרן 150 יקרומטר ב-13.8 אנרגיה קוו עם 4 x 1010 פוטונים/s וזמן חשיפה של 5 s לכל תמונה. תמונת עקיפה טיפוסית מוצגת באיור 5. לא ניתן לזהות פיזור רקע מוגבה על תמונת העקיפה. פרטים ניסיוניים נוספים, כמו גם סטטיסטיקות עיבוד נתונים משויכות, מפורטות בטבלה 2. איור 1 : מבט סכימטי של מחזיקי המדגם החדש. מחזיקי מדגם מורכב תמיכה פלסטיק שחור, אשר מכוסה בצד החיצוני עם מחזורית אמורקיים אולפין (coc) מחזורי הנייר. מסכל זה (צבעוני בכחול) הוא שקוף מאוד וריפוי עצמי. זה גם מבטיח את התכווצות הגז של הניסוי. הרדיד הפנימי (בצבע צהוב) עשוי מפולימיד ביו-אינרטי, שהוא שקוף מאוד לצילומי רנטגן. על נייר הכסף הזה, טיפות התגבשות ניתן להציב. השפה החיצונית של מחזיק המדגם מכיל שני עזרי מיקום המצוין על ידי החץ האדום (פאנל A), אשר מאפשר מיקום מדויק של מחזיק המדגם על החלל מלפני משומן הפרט של צלחת התגבשות. (א) מחזיק לדוגמה (סוג 1) עם קוטר 22 מ”מ עם טבעת תמיכה חיצונית קבועה. (ב) מחזיק לדוגמה (סוג 2) עם קוטר 22 מ”מ עם טבעת תמיכה חיצונית נשלפת. (ג) מחזיק לדוגמה (סוג 3) עם קוטר 18 מ”מ עם טבעת תמיכה חיצונית נשלפת. שני האחרונים פותחו לשימוש בהם בצורה גבוהה תפוקה עם רובוטים הרכבה אוטומטית לדוגמה באמצעות תקן השדרה. נקודות ההפסקה המיועדות מסומנות בחצים אדומים בלוח B. החץ השחור בלוח C מציין את סמן המיקום. הפינים הבולטות בהיקף החיצוני של הרדיד הצהוב נחוצים ליישור רדיד האלומיניום במהלך תהליך הייצור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2 : מחזיק הדגימה עשוי לשמש על צלחת לינברו 24-גם באותו אופן כמו מכסה מיקרוסקופ נפוץ לכסות. . הוא חותם את החלל האטום עזרי מיצוב להבטיח את המיקום הנכון של מחזיק המדגם על החלל (חיצים אדומים בלוח A). עד שלוש טיפות בודדות ניתן להציב על סוג 1 מחזיק לדוגמה (פאנל B), בעוד המספר המרבי המומלץ של טיפות ממוקם על סוג 2 או 3 מחזיק המדגם הוא שניים. אמצעי האחסון המומלץ ביותר עבור כל טיפה הוא 2 μL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3 : 24 סוג 1 בעלי מדגם להתאים על צלחת 24. מחזיקי המדגם ניתן להציב בשני הכיוונים על הצלחת 24-באר כפי שצוין (פאנל D). צינורית משמש כדי לחדור את רדיד COC בגב כדי להסיר משקאות חריפים מן ירידה התגבשות (פאנלים a ו- C) באמצעות הפתיל נייר הוכנס בעדינות באותו חור (פאנל B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4 : תמונה של ביצה תרנגולת-לבן קריסטלים ליזוזים נצפתה באמצעות מיקרוסקופ שידור מצויד מקטפה. גבישים בודדים מפלים בקלות מתמיסת חלבון זירז. הקריסטלים בתמונה זו הם בגודל ממוצע של 40 יקרומטר x 50 יקרומטר. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.  איור 5 : תמונת הפרדה טיפוסית של קרני רנטגן של גביש ליזוזים גדל על מחזיק המדגם. לפני החשיפה לצילומי רנטגן כל המשקאות האם העודפים הוסרו מסביב לגביש. נתוני עקיפה נאספו בטמפרטורת הסביבה על BL 14.3 בטבעת אחסון אלקטרון BESSY II32 באמצעות לחות בסביבה מבוקרת לדוגמה עם 97.5% לחות יחסית. אין רקע מוגבה בשל מחזיקי לדוגמה ניתן לצפות. הקווים המקווקו בתמונה מציינים את טבעות הרזולוציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 6 : מחזיק הדגימה מוכן לאיסוף נתונים עקיפה. ראשית, הסרט COC מוסר בעדינות על ידי שימוש מלקחיים ולאחר מכן לקלוף (פאנל a). לאחר מכן, מחזיק המדגם מוסר מן החלל ומוכנס לתוך החור המרכזי של בסיס מגנטי עד שצוין על-ידי הסמן (לוח B). על ידי החזקת החלק המרכזי, הלחץ העדין מוחל על הטבעת החיצונית כדי לשחרר את החלק המרכזי באמצעות סימטרי מסודרים נקודות הפסקה ייעודי (פאנל C). לאחר ההסרה, מחזיק המדגם יכול להיות צלל לתוך חנקן נוזלי והועבר לתוך בבקבוקונים סטנדרטי עמוד השדרה. ממוקם, למשל, ב-pucks הם יכולים להיות מועברים לאתרים סינכרוטרון שם אוטומטי הרכבה לדוגמה רובוטים לזהות אותם כדגימות רגיל (פאנל D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.  פרטים התגבשות שיטה טיפה תלויה, שיטת פיזור אדים סוג צלחת צלחות ברורות טמפ ‘ (K) 293 ריכוז חלבון (mg mL-1) 15 הרכב פתרון למאגר 50 mM NaAc pH 4.7, 500 mM הנאקל, 25% (w/v) יתד-6000 נפח ויחס של שחרור 2 μL בסך הכל, 1:1 יחס (חלבון: משקה אמא נפח של מאגר המים 500 מיקרומטר זמן דגירה 12 שעות טבלה 1: פרטים ניסיוניים של ניסוי התגבשות מתוארת. איסוף ועיבוד נתונים אורך הגל (Å) 0.89429 טמפ ‘ (K) 293 גלאי Rayonix MX225 CCD מרחק גלאי קריסטל (mm) 120 טווח סיבוב לכל תמונה (°) 0.5 טווח סיבוב כולל (°) 120 זמן חשיפה לכל תמונה מיכל 5 קבוצת חלל P43212 הפרמטרים של תאי היחידה (Å) a = 79.01, b = 79.01, c = 37.95 מוזניטי (°) 0.07 טווח רזולוציה (Å) 39.50-1.35 (1.37-1.35) מספר כולל של השתקפויות 191940 (8932) מספר השתקפויות ייחודיות 27020 (1292) שלמות (%) 99.88 (99.20) ריבוי 7.1 (6.9) אומר אני/σ (I) 15.0 (1.9) Rאני35 (%) 6.3 (107.0) Rpim36 (%) 2.4 (40.4) CC1/237  99.9 (68.5) . איסה38 16.1 וילסון ב’ פקטור (Å2) 17.0 טבלה 2: איסוף נתונים עקיפה וסטטיסטיקת עיבוד.

Discussion

התאמה לניסויי התגבשות. מחזיקי מדגם חדש ניתן להשתמש עבור תקן התגבשות שחרור תלוי ניסויים באמצעות 24-היטב לינברו סוג לוחות (סוגים 1 ו 2), או 24-ובכן לוחות טביעת רגל SBS שבו כל טוב יש קוטר של 18 מ”מ (סוג 3). ניתן להשתמש בהם במקום פתקי הכיסוי הסטנדרטיים של המיקרוסקופ. רדיד האלומיניום האמורגיים מבטיח את התכווצות האוויר של המערכת. הניטור של ניסוי התגבשות אפשרי באמצעות מיקרוסקופ אור שידור, בגלל השימוש ברחפות בהירות גבוהה. למיטב ידיעתנו, לא קיימים בעלי מדגם אחרים עבור לוחות התגבשות 24 שעות, אשר יאפשרו מניפולציה קריסטל או ניסויים עקיפה, ללא הסרת מכנית את הגביש מהטיפה, שבה הוא גדל. זה חשוב במיוחד, מאז חוקרים רבים בתחום עדיין להסתמך על צלחות כאלה עבור מיטוב גביש, בשל העובדה שניתן להשתמש באמצעי אחסון גדולים יותר לעומת 96-היטב לוחיות-שחרור. עם כרכים אלה טיפה גדולים יותר, ניתן להשיג קריסטלים גדולים יותר.

התאמה לטיפול בקריסטלים. בשל תכונות הריפוי העצמי של רדיד COC החיצוני והמבנה המיקרונקבובי של רדיד האלומיניום הצהוב הפנימי, הסביבה הגבישית נגישה וניתן לתמרן את הקריסטלים ללא העברתו מכנית לגורמים אחרים. זה הופך את בעלי הדגימה לנוחים מאוד. המערכת היחידה היחידה שאנו מכירים, המאפשרת גישה עקיפה ועדינה זו לגביש, היא מערכת CrystalDirect26. עם זאת, CrystalDirect הוא גמיש פחות מאז 96 מיוחד-לוחיות התגבשות היטב יש להשתמש. נייר הכסף, עליו גדלים הגבישים, הוא אותו החותם על ניסוי התגבשות והוא אינו מרפא את עצמו. משמעות הדבר היא כי הצמצם כי כבר מנוקב לתוך הנייר על ידי אבלציה לייזר עבור ליגנד או מסירה להגנה ההקפאה לקריסטלים יישאר פתוח, הגדלת הסיכוי לאידוי נוזלי. זה בניגוד לעיצוב שלנו, שם גבישים לא יהיו חשופים ישירות לסביבה גם אם רדיד COC מקבל פירסינג מספר פעמים.

התאמה לניסויים עקיפה באתרו בטמפרטורת הסביבה. מחזיק המדגם ניתן להסיר מלוחית התגבשות באופן ישר קדימה, תקוע על בסיס מגנטי ולשים על goniometer beamline. לניסוי עקיפה בטמפרטורת החדר, מומלץ להכניס את המדגם לזרם אוויר של לחות מוגדרת33. ליקר אמא סביב הגביש ניתן להסיר לפני לשים את מחזיק המדגם על מד זווית כדי להפחית את פיזור הרקע. מערכת כזו יציבה. במשך שעות

התאמת החומר המשמש לתפעול ואחסון ב 100 K. לא החומר המשמש לייצור מחזיק המדגם או הסרט פוליאימיד מושפעים לרעה על ידי קירור אותם לטמפרטורה נמוכה34. לפיכך, עבודה עם מחזיק המדגם בטמפרטורה נמוכה (g., 100 K) אינו מהווה בעיה רצינית.

התאמה לניסויים עקיפה באתרו ב-100 K. עבור איסוף נתונים ב 100 K בזרם חנקן, מחזיק המדגם צריך להיות מוסר מלוחית התגבשות כמו בפסקה הקודמת, תקוע על בסיס מגנטי ולשים לתוך זרם חנקן גז ב 100 K על goniometer בעלות. במקרה הצורך, המדגם עשוי להיות גם מוגן באמצעות ההקפאה, למרות שסביר להניח כי עבור דגימות עירום זה לא יהיה הכרחי ברוב המקרים31. לניסויים ב 100 K, מחזיקי המדגם סוג 2 ו 3 מתאימים יותר כי טבעת פלסטיק חיצונית ניתן להסיר. מכאן, הם בגודל קטן יותר, ולכן צריך להיות פחות נוטה לציפוי. עם זאת, ניתן להשתמש גם במחזיק לדוגמה מסוג 1. בהינתן לחות לא גבוהה מדי בהאטץ ‘ הניסיוני והציפוי הישר מערכת ההקפאה מיושר למחזיק הוא לא באמת בעיה.

מגבלות. הגיאומטריה של בעל המדגם מתיר איסוף נתונים עקיפה ללא הצורך על ידי שיטת סיבוב על טווח סיבוב הכולל של 160 °. זה מספיק כך שערכות נתונים עקיפה מלאה ניתן להשיג עבור רוב המערכות גביש. במקרים שבהם לא ניתן לעשות זאת, יש צורך למזג נתונים מיותר מגביש ביחד. כאשר הקריסטלים מגודלים יחד, ייתכן שניתן יהיה להתאים את גודל קרן הרנטגן של האירוע כך שרק חלקים מקריסטלים בודדים ייחשפו. במקרים קיצוניים, ייתכן שיהיה צורך לפנות לאסטרטגיית איסוף המידע הדומה ל35 הגישההראשונה. לסיכום, בעוד יש מגבלות מסוימות הקשורות מחזיקי המדגם, אלה יכולים להיות להתגבר ברוב המקרים. כמובן, זה תמיד אפשרי שנתקלים במצבים שבהם שום דבר מזה אינו אפשרי. במקרים כאלה, ייתכן שיהיה צורך לאתר שיטות אחרות להרכבת קריסטלים.

תיארנו סוג הרומן של מחזיק לדוגמה עבור קריסטלוגרפיה macromolecular והדגמנו את ההתאמה של מחזיקי מדגם עבור יישומים שונים. לוקח בחשבון את הטיפול פשוט להתגלות של גבישי חלבון, כמו גם את המאפיינים הייחודיים של מחזיקי מדגם, אנו מאמינים כי אלה מחזיקי לדוגמה תוכיח להיות תוספת רבת ערך לארסנל של מחזיקי מדגם עבור macromolecular קריסטלוגרפיה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות BESSY II, מופעל על ידי הלמהולץ-זנטרום ברלין על הגישה והתמיכה של הקרן, ואת המחלקות של איכות סביבה ועיצוב טכני לעזרתם עם עיצוב ובנייה וגישה למתקני מדפסת תלת-ממד.

Materials

AF Satetiss RS Components 101-5738 lint-free paper, multiple retailer
Cannula Dispomed Neoject 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 multiple retailer
COC foil HJ-Bioanalytik GmbH 900360
ComboPlate Greiner Bio-one / Jena Bioscience 662050 / CPL-131 pre-greased plate, multiple retailer
Cryo Vials Jena Bioscience CV-100
Eppendorf Research Plus  Eppendorf 3123000012 0.1 – 2.5 µL volume
Eppendorf Tubes Eppendorf 30125150 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number
Forceps Usbeck FisherScientific 10750313
GELoader Eppendorf Quality Eppendorf 30001222 extruded  tips (0.2 – 20 µL), manufacturer reference number
Magnetic CryoVials Molecular Dimension MD7-402
Microfuge Thermo ThermoFisher Scientific R21
Paper wicks dental2000 64460 Set of paper wicks, multiple retailer
Rotiprotect Nitril-eco  Carl Roth TC14.1 powder free, multiple retailer
SuperClear Plates Jena Bioscience CPL-132 pre-greased plate
UHU super glue UHU GmbH & Co KG 45545 manufacturer reference number, multiple retailer
VeroBlackPlus Alphacam OBJ-40963 manufacturer reference number
XtalTool  Jena Bioscience X-XT-101 sample holder set
XtalTool HT Jena Bioscience X-XT-103 / X-XT-104 SPINE compatible sample holder set
XtalToolBases Jena Bioscience X-XT-105 Magnetic sample holder bases set
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  2. Mac Sweeney, A., D’Arcy, A. A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature. Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).
  3. Kalinin, Y., et al. A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography. Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).
  4. Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).
  5. Pflugrath, J. W. Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures. Methods. 34 (3), 415-423 (2004).
  6. Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
  7. Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).
  8. Martínez-Rodríguez, S., et al. Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).
  9. Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
  10. Teng, T. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  11. Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O’Neill, K., Gillilan, R. Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).
  12. Jian-Xun, Q., Fan, J. An improved loopless mounting method for cryocrystallography. Chinese Physics B. 19 (1), 010601 (2010).
  13. Kitatani, T., et al. New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material. Applied Physics Express. 1 (3), 037002 (2008).
  14. Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).
  15. Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter. Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).
  16. Parkin, S., Hope, H. Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals. Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).
  17. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  18. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5, 10451 (2015).
  19. Roedig, P., et al. Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).
  20. Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).
  21. Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
  22. Feld, G. K., et al. Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).
  23. le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).
  24. Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).
  25. Aller, P., et al. Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).
  26. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).
  27. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  28. Antimonov, M., et al. Large-area Kapton x-ray windows. Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F (2015).
  29. McPherson, A. Penetration of dyes into protein crystals. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).
  30. Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. Raoult’s law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).
  31. Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary?. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).
  32. Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
  33. Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
  34. Yano, O., Yamaoka, H. Cryogenic properties of polymers. Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).
  35. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).

Tags

Macromolecular X-ray CrystallographySample Holder24-well PlateMinimal Background ScatteringCrystal Growth MonitoringCryoprotectionPaper WickCOC FoilPolyimide Foil

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Feiler, C. G., Wallacher, D., Weiss, M. S. An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering. J. Vis. Exp. (149), e59722, doi:10.3791/59722 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image