JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
italiano

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Un portacampioni all-in-one per la cristallografia a raggi X macromolecolare con una dispersione minima dello sfondo

Published: July 06, 2019
doi:
10.3791/59722
, ,
1Macromolecular Crystallography (HZB-MX),Helmholtz-Zentrum Berlin, 2Department Sample Environment,Helmholtz-Zentrum Berlin

Summary

Viene presentato un nuovo supporto campione per la cristallografia macromolecolare a raggi X insieme a un protocollo di manipolazione adatto. Il sistema consente la crescita dei cristalli, l’ammollo cristallino e la raccolta dei dati di diffrazione in situ sia a temperatura ambiente che criogenica senza la necessità di alcuna manipolazione o montaggio del cristallo.

Abstract

La cristallografia a raggi X macromolecolare (MX) è il metodo più importante per ottenere una conoscenza tridimensionale ad alta risoluzione delle macromolecole biologiche. Un prerequisito per il metodo è che il campione cristallino altamente ordinato deve essere coltivato dalla macromolecola da studiare, che poi devono essere preparati per l’esperimento di diffrazione. Questa procedura di preparazione prevede tipicamente la rimozione del cristallo dalla soluzione, in cui è stato coltivato, ammollo del cristallo in soluzione di ligando o soluzione crio-protettrice e quindi immobilizzando il cristallo su un supporto adatto per l’esperimento. Un problema serio per questa procedura è che i cristalli macromolecolari sono spesso meccanicamente instabili e piuttosto fragili. Di conseguenza, la manipolazione di tali cristalli fragili può facilmente diventare un collo di bottiglia in un tentativo di determinazione della struttura. Qualsiasi forza meccanica applicata a tali cristalli delicati può disturbare l’imballaggio regolare delle molecole e può portare a una perdita di potenza di diffrazione dei cristalli. Qui, presentiamo un nuovo portacampioni all-in-one, che è stato sviluppato al fine di ridurre al minimo le fasi di movimentazione dei cristalli e quindi per massimizzare il tasso di successo dell’esperimento di determinazione della struttura. Il supporto del campione supporta la configurazione di gocce di cristallo sostituendo le vesche di copertura del microscopio comunemente utilizzate. Inoltre, permette la manipolazione in-place del cristallo come l’ammollo del ligando, la crio-protezione e la formazione complessa senza alcuna apertura della cavità di cristallizzazione e senza manipolazione del cristallo. Infine, il supporto del campione è stato progettato per consentire la raccolta di dati di diffrazione a raggi X in situ sia a temperatura ambiente che criogenica. Utilizzando questo supporto campione, le possibilità di danneggiare il cristallo durante il suo percorso dalla cristallizzazione alla raccolta dei dati di dimezzati sono notevolmente ridotte poiché la movimentazione diretta del cristallo non è più necessaria.

Introduction

La conoscenza della struttura tridimensionale delle macromolecole biologiche costituisce un’importante pietra angolare in tutta la ricerca biologica, biochimica e biomedica di base. Questo si estende anche ad alcuni aspetti traslazionali di tale ricerca, come ad esempio la scoperta di farmaci. Tra tutti i metodi per ottenere tali informazioni tridimensionali alla cristallografia a raggi X a risoluzione atomica è il più potente e il più importante, come dimostra il fatto che il 90% di tutte le informazioni strutturali disponibili è contribuito dai raggi X cristallografia1. Il principale prerequisito della cristallografia a raggi X, che è allo stesso tempo la sua principale limitazione, è che i cristalli di qualità di diffrazione debbano essere prodotti e preparati per l’esperimento di diffrazione. Questo passaggio costituisce ancora uno dei principali colli di bottiglia del metodo.

Storicamente, i dati di diffrazione provenienti da cristalli proteici sono stati raccolti a temperatura ambiente. I singoli cristalli sono stati accuratamente trasferiti in capillari di vetro o quarzo prima della raccolta dei dati, il liquore madre è stato aggiunto ai capillari in modo che i cristalli non si asciughino e i capillari fossero sigillati2,3, 4. A partire dagli anni ’80, è diventato sempre più evidente che, a causa delle proprietà ionizzanti della radiazione X e dell’imminente sensibilità alle radiazioni dei cristalli macromolecolari, la raccolta dei dati a temperatura ambiente pone gravi limitazioni sul metodo. Di conseguenza, sono stati sviluppati approcci per mitigare gli effetti dei danni da radiazioni raffreddando cristalli macromolecolari fino a 100 K e per raccogliere dati di diffrazione a temperatura così bassa5,6. Per lavorare a basse temperature, il montaggio dei campioni nei capillari è diventato impraticabile a causa del basso tasso di trasferimento di calore. Nonostante ciò, ci sono sforzi in corso per utilizzare anche i capillari, in particolare dagli esperimenti di cristallizzazione contro-diffusione, per il lavoro di diffrazione a bassa temperatura7,8, ma, indipendentemente da ciò, è diventato lo standard approccio in cristallografia macromolecolare per montare cristalli macromolecolari tenuto da una sottile pellicola di liquore madre all’interno di un sottile anello cablato9,10. Anche se nel corso del tempo sono stati apportati una serie di miglioramenti (ad esempio, l’introduzione di anelli litografici e strutture simili11) a questo montaggio basato su loop, i principi di base sviluppati all’inizio degli anni ’90 sono ancora in uso oggi. Si può affermare in modo sicuro che la maggior parte delle raccolte di dati di diffrazione su cristalli macromolecolari oggi ancora si basano su questo approccio5.

Nel corso del tempo, ci sono stati alcuni interessanti nuovi sviluppi e modifiche del metodo di montaggio basato su loop, ma questi approcci non sono stati finora ampiamente adottati nella comunità. Uno è il cosiddetto montaggio senza loop dei cristalli, che è stato sviluppato per ottenere una dispersione dello sfondo inferiore12,13,14. Un altro è l’uso di guaine al grafene per avvolgere i campioni cristallini e proteggerli dall’essiccazione. Il grafene è un materiale adatto in questo senso a causa del suo bassissimo sfondo a raggi X15.

Più recentemente, gli sviluppi nel campo dei supporti campione si sono concentrati principalmente sulla standardizzazione dei supporti con l’obiettivo di aumentare la velocità effettiva del campione16 o sulla progettazione di supporti, che può contenere più di un campione17, ad esempio membrane modellate su un telaio in silicio, che sono in grado di contenere centinaia di piccoli cristalli per lo più nel campo della cristallografia seriale18,19,20,21,22.

Tutti i metodi di montaggio del campione discussi finora richiedono ancora un certo grado di intervento manuale, il che significa che c’è un pericolo intrinseco di causare danni meccanici al campione. Pertanto, si cercano nuovi approcci progettando l’ambiente campione in modo che i dati di diffrazione dei cristalli possano essere raccolti all’interno del loro ambiente di crescita. Uno di questi metodi è chiamato in situ o plate-screening23,24 ed è già implementato in una serie di linee di fascio cristallografia macromolecolare a varie fonti di sincrotrone in tutto il mondo25. Tuttavia, l’uso di questo metodo è limitato dai parametri geometrici della piastra di cristallo e dallo spazio disponibile intorno al punto campione dello strumento.

Ancora un altro approccio si realizza nel cosiddetto sistema CrystalDirect26. Qui, intere gocce di cristallizzazione vengono raccolte automaticamente. I fogli su cui sono stati coltivati i cristalli sono tagliati su misura utilizzando un laser e utilizzati direttamente come supporto del campione27.

Nel lavoro qui descritto, l’obiettivo era quello di sviluppare un supporto campione, che permettesse all’utente di spostare il campione cristallino dalla sua camera di crescita al dispositivo di raccolta dati senza toccarlo e che consentisse all’utente di manipolare facilmente il campione. Poiché molti ricercatori nel campo della cristallografia macromolecolare utilizzano ancora il formato di cristallizzazione a 24 pozze per ottimizzare la crescita dei cristalli modificando le condizioni identificate nelle grandi campagne di screening, il nuovo detentore del campione è stato progettato per essere compatibile con questo formato. Di seguito, verrà descritta la progettazione del nuovo detentore del campione e saranno dimostrate la gestione e le prestazioni del titolare del campione per la raccolta e l’ammollo dei dati in situ. Infine, saranno discussi l’idoneità di questo nuovo detentore del campione e i suoi limiti per le varie fasi di lavoro.

Protocol

AVVISO: Per tutti i lavori successivi, è molto importante che la lamina di poliimide di colore giallo non debba essere toccata con dita non protette, a causa di possibili contaminazioni al supporto campione. Inoltre, l’uso di pinze protette è altamente raccomandato. 1. Il portacampioni Utilizzare uno dei tre tipi di supporto del campione.NOTA: nella figura 1sono illustrate tre diverse versioni del nuovo supporto di esempio sviluppato. Tutti contengono una struttura di supporto in plastica nera, un foglio di COC ermetico all’esterno e un foglio di poliimide strutturato microporoso all’interno. Tipo 1 (Figura 1A) contiene un anello di plastica esterna fissa, mentre per i tipi 2 e 3 (Figura 1B,1C) l’anello esterno può essere rotto meccanicamente nei rispettivi punti di interruzione designati per l’utilizzo in sistemi di trasferimento di campioni automatizzati (vedere rosso frecce nella figura 1B). Il design dei supporti del campione consente l’impostazione di più gocce di cristallizzazione sulla lamina di poliimide gialla. Non compromette il monitoraggio dell’esperimento di cristallizzazione, in quanto il materiale è altamente trasparente per la luce visibile. La lamina di poliimide spessa 21 m presenta anche 5 pori, che consente una semplice manipolazione dei cristalli immergendosi in seguito. Poiché la trasmissione dei raggi X è vicina a 1,0 a tutte le energie di raccolta dei dati di diffrazione comunemente utilizzate nella cristallografia macromolecolare, il contributo della lamina alla dispersione dello sfondo in un esperimento di diffrazione è trascurabile28. 2. Impostazione di gocce di cristallizzazione Creare una superficie pulita e priva di polvere utilizzando un panno umido senza lanugine. Prendere un supporto campione dalla sua scatola e posizionarlo delicatamente, lamina gialla rivolta verso l’alto, sulla superficie pulita per evitare danni o foratura indesiderata della lamina di COC posteriore. Impostare le gocce di cristallizzazione con un volume massimo consigliato di 2 gradi sulla lamina gialla come sarebbe fatto su vetrini di copertura comunemente utilizzati. Mettere delicatamente le gocce per evitare qualsiasi rottura o piercing della lamina utilizzando una pipetta. Su un portaoggetti di tipo 1 (Figura2A) è possibile inserire fino a tre gocce, mentre su detentori di campioni di tipo 2 e 3 due gocce sono il massimo raccomandato (Figura 2C). Capovolgere il supporto del campione e posizionarlo su una cavità pre-grassa di una piastra in stile Linbro di 24 piani. Utilizzare gli strumenti di posizionamento (vedere frecce rosse nella Figura 1A) del supporto del campione per guidarlo alla sua posizione ottimale. Assicurarsi la corretta posizione del supporto del campione per evitare l’evaporazione indesiderata (Figura 2A). 3. Osservare la crescita dei cristalli Mettendo la piastra di cristallizzazione al microscopio a luce di trasmissione, con o senza polarizzatori, monitorare la crescita del cristallo senza alcun disturbo dell’esperimento (Figura 4). Quando si utilizzano i più piccoli portacampioni da 18 mm di tipo 3 (Figura1C),progettati per l’uso su piastre di impronte SBS, utilizzare un robot di imaging in grado di gestire piastre SBS-footprint per monitorare la crescita dei cristalli in modo più automatizzato. 4. Manipolazione dei cristalli NOTA: Si consiglia di eseguire tutte le fasi successive al microscopio della luce di trasmissione. Crio-protezione Forare delicatamente il foglio di COC esterno con una cannula fine. Assicurarsi che la lamina gialla interna rimanga intatta. La foratura dovrebbe trovarsi accanto alla goccia che deve essere manipolata (Figura 3A,3C). Utilizzare uno stoppino di carta fine e inserirlo nel foro in flocco. Spingere con attenzione lo stoppino in avanti fino a toccare la lamina di poliimide gialla. Tenere lo stoppino a contatto con la lamina perforata. Lo stoppino succhia via tutta la soluzione in eccesso. Il tempo necessario per la rimozione completa del liquido dipende dalla viscosità delle soluzioni e dalla composizione del liquore madre (Figura 3B). Dopo che tutto il liquido viene aspirato, ritrarre delicatamente lo stoppino della carta. Ricordate la posizione della goccia, dal momento che potrebbe non essere visibile dopo la rimozione del liquore madre. Prendi una pipetta standard per applicare un piccolo volume di soluzione crio-protettrice, max. 3 L, utilizzando una punta estrusa (ad esempio, una punta di carico gel) attraverso lo stesso foro. Una volta erogato il liquido, ritrarre la punta. La porosità della lamina gialla permette la diffusione attraverso la lamina. Il tempo necessario per ottenere una protezione crio-protezione dei cristalli dipende in larga posizione dalla soluzione impiegata e dai suoi componenti. Per risiedere il foglio di COC auto-guarigione, posizionare delicatamente un dito protetto sul foro per circa 1 s e farlo scorrere attraverso la foratura. La leggera pressione in combinazione con la temperatura elevata favorirà la risuntura delle forature, che non sono troppo grandi. Ligand ammolloNOTA: Il liquore materno in eccesso può essere rimosso prima dell’ammollo del ligando. A tale scopo, seguire i passaggi descritti in 4.1.1 a 4.1.3. Sciogliere il ligando in liquore madre nella concentrazione desiderata in un tubo di reazione. Girare la soluzione per 10 minuti a 12.000 x g per rimuovere le particelle insolubili. Se necessario, utilizzare una centrifuga a temperatura controllata. Posizionare delicatamente un volume di max. 3 L di ligando contenente soluzione nel divario tra la lamina di COC e la pellicola di poliimide utilizzando una lunga punta di tubo estruso. Ritirare la punta. Per risiedere il foglio di COC auto-guarigione, posizionare delicatamente un dito protetto sul foro per circa 1 s e farlo scorrere attraverso la foratura (vedi anche 4.1.5). Incubare l’esperimento per qualche tempo per consentire la diffusione attraverso la membrana. Il tempo di ammollo dipende fortemente dalla viscosità della soluzione di diffazione e dei suoi componenti29. Ripetere i passaggi da 4.2.1 a 4.2.5 più volte per immergere successivamente diversi ligandi. 5. Raccolta dei dati di diffrazione in situ a temperatura ambiente NOTA: per ridurre al minimo la dispersione dei solventi, rimuovere la soluzione in eccesso prima della raccolta dei dati. Garantire un ambiente a travi a controllo dell’umidità stabile con condizioni prestabilite30. Sollevare delicatamente la pellicola di COC trasparente nel punto designato con pinze e staccarlo come se si rimuovesse il coperchio da una tazza di yogurt ( Figura 6B). Sollevare delicatamente il supporto del campione dalla cavità e inserirlo immediatamente in una base di supporto del campione magnetico pre-preparata. Per questo passaggio non è necessaria alcuna colla (Figura 6B). Applicare una leggera pressione per garantire il corretto posizionamento del supporto del campione all’interno della base. Montare il supporto del campione su un goniometro trave e assicurarsi il corretto posizionamento del supporto. A seconda della geometria del goniometro, il supporto del campione può essere ruotato fino a 160 gradi senza causare alcuna ombra durante l’esperimento di diffrazione. Utilizzare uno stoppino di carta e toccare delicatamente la lamina in poliimide gialla dal retro per rimuovere il liquore madre in eccesso. Si prega di notare che in quella fase ligando ammollo o crio-protezione può essere eseguita altrettanto bene. Il campione è ora pronto per la centratura e la raccolta dei dati di diffrazione. Quando si utilizza un supporto campione con anello esterno rimovibile, applicare una leggera pressione tenendol’anello esterno e romperlo in corrispondenza dei punti di interruzione designati (Figura 6C). Il campione è ora pronto per la centratura e la raccolta dei dati di diffrazione. 6. Raccolta dei dati di diffrazione in situ a temperatura criogenica NOTA: Si consiglia di rimuovere il liquore madre residuo dal campione eseguendo i passaggi 4.1.1. a 4.1.3. prima di continuare con i passaggi successivi per ridurre al minimo la dispersione del solvente. La maggior parte dei campioni può essere trasferita in azoto liquido senza crio-protezione preventiva31. Se è necessaria la crioprotezione, vedere i passaggi 4.1.1. a 4.1.5. Sollevare delicatamente la pellicola di COC nel punto designato utilizzando una pinza e staccarla (vedere il passaggio 5.1.2) (Figura 6A). Togliere il supporto del campione dalla cavità e montarlo su una base magnetica del supporto del campione. Una leggera pressione può essere applicata per garantire un raccordo corretto e stretto (vedere il passaggio 5.1.5, La figura 6B).NOTA: i punti di interruzione designati simmetricamente consentono la semplice rimozione dell’anello esterno del supporto campione applicando una leggera pressione (vedere il passaggio 5.1.8., figura 6C). Ora, il supporto del campione è pronto e può essere immerso in azoto liquido. La geometria dei tipi di supporto campione 2 e 3 (Figura 1B,1C) consente il trasferimento nelle fiale campione SPINE standard, che possono essere utilizzate per il montaggio di campioni assistiti dal robot (Figura 6D).

Representative Results

Il supporto del campione di tipo 1 è stato progettato in modo che si adatti a un pozzo di una piastra in stile Linbro a 24 pozze. Ogni singolo supporto campione contiene ausili di posizionamento su entrambi i lati del bordo esterno al fine di garantire un posizionamento ottimale sul bordo del pozzo (Figura 1A, Figura 2A). Fino a tre singole gocce di cristallizzazione di volume massimo 2 – L ciascuna possono essere posizionate sul foglio di poliimide giallo (Figura 2B). Per i possessori di campioni di tipo 2 e 3, si consiglia di impostare un massimo di due gocce di volume massimo 2. 24 portacampioni possono essere montati su una piastra Linbro da 24 piani (Figura3D). È stato creato un esperimento di cristallizzazione su una piastra Linbro a 24 piani utilizzando il supporto campione di tipo 1. 1 luna di gallina uovo-bianca lysozyme soluzione (15 mg/mL) è stato mescolato con 1 -L di liquore madre comprendente 50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl e 25% (w/v) PEG-6000 sul foglio di poliofe gialla sul supporto del campione (Tabella 1). La goccia è stata equilibrata a 293 K contro 500 , l’una di liquore materno e cristalli della dimensione di 40-50 m sono stati osservati dopo 5 ore (Figura4). La crescita dei cristalli può essere osservata utilizzando un microscopio luminoso di trasmissione (Figura 4) con o senza un polarizzatore. Le pellicole ad alta trasparenza garantiscono la migliore osservazione e monitoraggio delle condizioni di crescita dei cristalli utilizzando entrambi, un microscopio luminoso convenzionale o un sistema di imaging automatico dei cristalli. L’osservazione della crescita cristallina con luce UV non è stata testata. Dopo aver rimosso il liquore materno da circa i cristalli, un portacampioni con cristalli lisozime bianco uovo di gallina è stato prelevato dalla piastra di cristallizzazione e posto in un flusso d’aria controllato dall’umidità sulla trave 14.33 32. I dati relativi alla diffrazione sono stati raccolti a temperatura ambiente con incrementi di 1o metro utilizzando un fascio di 150 m a 13,8 keV di energia da 13,8 keV con 4 x 1010 fotoni/s e un tempo di esposizione di 5 s per immagine. Una tipica immagine di diffrazione è illustrata nella figura 5. Non è possibile rilevare alcuna dispersione dello sfondo elevata sull’immagine di diffrazione. Ulteriori dettagli sperimentali e le statistiche di elaborazione dei dati associati sono elencati nella tabella 2. Figura 1 : vista schematica dei nuovi possessori del campione. I portacampioni sono costituiti da un supporto in plastica nera, che è coperto sul lato esterno con un foglio di copolimero di olelamero (COC) ciclico amorfo. Questo foglio (colorato in blu) è altamente trasparente e auto-guarigione. Garantisce inoltre la tenuta del gas dell’esperimento. La lamina interna (colorata in giallo) è fatta di poliimide bio-inerte, che è altamente trasparente per i raggi X. Su questo foglio, le gocce di cristallizzazione possono essere posizionate. Il bordo esterno del supporto del campione contiene due ausili di posizionamento indicati dalla freccia rossa (pannello A), che consente il posizionamento accurato del supporto del campione sulla singola cavità pre-grassa della piastra di cristallizzazione. (A) Portaoggetti (tipo 1) con un diametro di 22 mm con un anello di supporto esterno fisso. (B) Portaoggetti (tipo 2) con diametro di 22 mm con anello di supporto esterno rimovibile. (C) Portaoggetti (tipo 3) con 18 mm di diametro con anello di supporto esterno rimovibile. Questi ultimi due sono stati sviluppati per utilizzarli in modo ad alta produttività con robot di montaggio campione automatizzati che utilizzano lo standard SPINE. I punti di interruzione designati sono evidenziati dalle frecce rosse nel pannello B. La freccia nera nel pannello C indica il marcatore di posizionamento. I perni sporgenti nel perimetro esterno della lamina gialla sono necessari per allineare la lamina di poliimide durante il processo di produzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : Il supporto del campione può essere utilizzato su una piastra Linbro a 24 pozzetti allo stesso modo degli scivoli di copertura del microscopio comunemente utilizzati. Sigilla la cavità ermetica. Gli ausili di posizionamento garantiscono il corretto posizionamento del supporto campione sulla cavità (frecce rosse nel pannello A). Fino a tre singole gocce possono essere posizionate su un supporto campione di tipo 1 (pannello B), mentre il numero massimo raccomandato di gocce posizionate su un supporto campione di tipo 2 o 3 è due. Il volume massimo consigliato per ogni goccia è 2 . Figura 3 : 24 supporti campione di tipo 1 si adattano su una piastra di 24 pozze. I supporti del campione possono essere posizionati in due orientamenti sulla piastra 24-well come indicato (pannello D). Una cannula viene utilizzata per forare la pellicola COC posteriore per rimuovere il liquore in eccesso da una goccia di cristallizzazione (pannelli A e C)utilizzando uno stoppino di carta delicatamente inserito nello stesso foro (pannello B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : Immagine di cristalli lisozimi bianco uovo di gallina osservati attraverso un microscopio di trasmissione dotato di un polarizzatore. I singoli cristalli sono facilmente discriminati dalla soluzione proteica precipitata. I cristalli in questa immagine sono di una dimensione media di 40 m x 50 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.  Figura 5 : Una tipica immagine di diffrazione a raggi X di un cristallo lysozyme coltivato sul supporto del campione. Prima dell’esposizione ai raggi X, tutto il liquore madre in eccesso veniva rimosso da tutto il cristallo. I dati di diffrazione sono stati raccolti a temperatura ambiente su BL14.3 presso l’anello di stoccaggio degli elettroni BESSY II32 utilizzando un ambiente campione controllato dall’umidità con umidità relativa del 97,5%. Non è possibile osservare alcun sopravfondo a causa dei titolari del campione. Le linee tratteggiate nell’immagine indicano gli anelli di risoluzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 : Il portaoggetti del campione è preparato per la raccolta dei dati di diffrazione. In primo luogo, la pellicola COC viene sollevata delicatamente utilizzando una pinza e poi staccata (pannello A). Successivamente, il supporto del campione viene rimosso dalla cavità e inserito nel foro centrale di una base magnetica fino a quando indicato dal marcatore (pannello B). Tenendo la parte centrale, viene applicata una leggera pressione all’anello esterno per liberare la parte centrale utilizzando i punti di interruzione designati simmetricamente (pannello C). Dopo la rimozione, il supporto del campione può essere immerso in azoto liquido e trasferito nelle fiale SPINE standard. Posizionati, ad esempio, in dischi, possono essere trasportati in siti di sincrotrone dove i robot automatizzati di montaggio dei campioni li riconoscono come campioni regolari (pannello D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.  Dettagli di cristallizzazione metodo Goccia appesa, metodo di diffusione del vapore Tipo di piastra Piastre SuperClear Temperatura (K) 293 (di cinità) Concentrazione proteica (mg mL-1) 15 Mi lasa del sistema Composizione della soluzione del serbatoio 50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl, 25 % (w/v) PEG-6000 Volume e rapporto di calo 2 – Totale L, 1:1 rapporto (proteina : liquore madre Volume del serbatoio 500 lL Tempo di incubazione Ore 12 Tabella 1: Dettagli sperimentali dell’esperimento di cristallizzazione descritto. Raccolta ed elaborazione dei dati Lunghezza d’onda (a) 0,89429 Temperatura (K) 293 (di cinità) rivelatore m Rayonix MX225 CCD Distanza rivelatore di cristalli (mm) 120 Intervallo di rotazione per immagine 0,5 0,5 Gamma di rotazione totale (z) 120 Tempo di esposizione per immagine (s) 5 Del numero 3( Gruppo spaziale P43212 Parametri delle celle di unità (z) a : 79,01, b , 79,01, c , 37,95 Mosacity 0,07 (in vi estati) Intervallo di risoluzione (z) 39.50 – 1.35 (1.37 – 1.35) Numero totale di riflessioni 191940 (8932) Numero di riflessi univoci 27020 (1292) Completezza (%) 99,88 (99,20) molteplicità f inv 7.1 (6,9) Media I/ 15,0 (1,9) Rmeas35 (%) 6.3 (107.0) Rpim36 (%) 2.4 (40,4) CC1/237  99,9 (68,5) ISa38 16.1 1 Fattore B diWilson (2 ) 17,0 17 Tabella 2: Statistiche di raccolta ed elaborazione dei dati di diffrazione.

Discussion

Idoneità per esperimenti di cristallizzazione. I nuovi supporti possono essere utilizzati per esperimenti standard di cristallizzazione delle gocce appese utilizzando piastre tipo Linbro da 24 pozze (tipo 1 e 2) o piastre di ingombro SBS di 24 pozze. Possono essere utilizzati al posto degli scivoli di copertura standard del microscopio. La lamina amorfa di COC garantisce la tenuta ermetica del sistema. Il monitoraggio dell’esperimento di cristallizzazione è possibile utilizzando un microscopio a luce di trasmissione, a causa dell’uso di fogli ad alta chiarezza. Per quanto ne sappiamo, non esistono altri portacampioni per piastre di cristallizzazione a 24 pozze, che consentirebbero la manipolazione dei cristalli o esperimenti di diffrazione, senza rimuovere meccanicamente il cristallo dalla goccia, in cui viene coltivato. Questo è di particolare importanza, dal momento che molti ricercatori nel campo si affidano ancora a tali piastre per l’ottimizzazione dei cristalli, a causa del fatto che grandi volumi di goccia possono essere utilizzati rispetto a 96-bene piastre sedute-drop. Con questi grandi volumi di goccia, si possono ottenere cristalli più grandi.

Idoneità per la manipolazione deicristalli. A causa delle proprietà auto-riparanti della lamina di COC esterna e della struttura microporosa della lamina di poliimide giallo interna, l’ambiente cristallino è accessibile e i cristalli possono essere manipolati senza trasferirli meccanicamente ad altri contenitori. Questo rende i supporti campione molto convenienti. L’unico altro sistema che conosciamo, che permette questo accesso indiretto e delicato al cristallo, è il sistema CrystalDirect26. Tuttavia, CrystalDirect è meno flessibile in quanto devono essere utilizzate speciali piastre di cristallizzazione a 96 pozze. Il foglio, su cui crescono i cristalli, è lo stesso che sigilla l’esperimento di cristallizzazione e non è auto-guarigione. Ciò significa che un’apertura che è stata trafitta nella lamina dall’ablazione laser per il ligando o dalla consegna crio-protettrice ai cristalli rimarrà aperta, aumentando la possibilità di evaporazione liquida. Questo è in contrasto con il nostro progetto, dove i cristalli non saranno direttamente esposti all’ambiente anche se la lamina di COC viene trafitta un certo numero di volte.

Idoneità per esperimenti di diffrazione in situ a temperatura ambiente. Il supporto del campione può essere rimosso dalla piastra di cristallizzazione in modo rettilineo, attaccato su una base magnetica e messo su un goniometro trave. Per un esperimento di diffrazione a temperatura ambiente, si consiglia di mettere il campione in un flusso d’aria di umidità definita33. Il liquore madre intorno al cristallo può essere rimosso prima di mettere il supporto del campione sul goniometro al fine di ridurre la dispersione dello sfondo. Tale allestione è stabile per ore.

Idoneità del materiale utilizzato per il funzionamento e lo stoccaggio a 100 K. Né il materiale utilizzato per la produzione del portacampione né la pellicola in poliimide sono influenzati negativamente dal raffreddamento fino a basse temperature34. Quindi, lavorare con il supporto del campione a bassa temperatura (ad esempio, 100 K) non rappresenta un problema serio.

Idoneità per esperimenti di diffrazione in situ a 100 K. Per la raccolta dei dati a 100 K in un flusso di azoto, il supporto del campione deve essere rimosso dalla piastra di cristallizzazione come nel paragrafo precedente, bloccato su una base magnetica e messo in un flusso di azoto gassoso a 100 K su un goniometro trave. Se lo si desidera, il campione può anche essere protetto da crio, anche se è probabile che per i campioni nudi questo potrebbe non essere necessario nella maggior parte dei casi31. Per gli esperimenti a 100 K, i supporti campione di tipo 2 e 3 sono più adatti perché l’anello di plastica esterno può essere rimosso. Di conseguenza, sono di dimensioni più piccole e dovrebbero quindi essere meno inclini alla glassa. Tuttavia, può essere utilizzato anche un detentore di campioni di tipo 1. Data un’umidità non troppo alta nella capanna sperimentale e una glassa crio-sistema correttamente allineato fino al supporto non è davvero un problema.

Limitazioni. La geometria del supporto del campione consente la raccolta di dati didiffrazione senza ostacoli mediante il metodo di rotazione su un intervallo di rotazione totale di 160 gradi. Ciò è sufficiente in modo che i set di dati di diffrazione completi possano essere ottenuti per la maggior parte dei sistemi cristallini. Nei casi in cui ciò non è possibile, i dati provenienti da più di cristalli devono essere uniti. Quando i cristalli vengono coltivati insieme, potrebbe essere possibile regolare le dimensioni del fascio di raggi X incidente in modo che siano esposte solo parti di singoli cristalli. In casi estremi, potrebbe essere necessario ricorrere a una strategia di raccolta dati simile all’approccio MeshAndCollect35. In sintesi, sebbene vi siano alcune limitazioni associate ai detentori del campione, queste possono essere superate nella maggior parte dei casi. Naturalmente, è sempre possibile che si incontrino situazioni, in cui nulla di tutto ciò è possibile. In questi casi, potrebbe essere necessario ricorrere ad altri metodi di montaggio dei cristalli.

Abbiamo descritto un nuovo tipo di portacampioni per la cristallografia macromolecolare e abbiamo dimostrato l’idoneità dei supporti del campione per varie applicazioni. Tenendo conto della manipolazione semplice e riproducibile dei cristalli proteici, nonché delle proprietà uniche dei detentori del campione, riteniamo che questi titolari di campioni si riveleranno una preziosa aggiunta all’arsenale di detentori di campioni per Cristallografia.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare BESSY II, gestito da Helmholtz-Etrum Berlin per l’accesso e il supporto al tempo di trave, e i dipartimenti di ambiente campione e progettazione tecnica per il loro aiuto con la progettazione e la costruzione e l’accesso alle strutture di stampa 3D.

Materials

AF Satetiss RS Components 101-5738 lint-free paper, multiple retailer
Cannula Dispomed Neoject 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 multiple retailer
COC foil HJ-Bioanalytik GmbH 900360
ComboPlate Greiner Bio-one / Jena Bioscience 662050 / CPL-131 pre-greased plate, multiple retailer
Cryo Vials Jena Bioscience CV-100
Eppendorf Research Plus  Eppendorf 3123000012 0.1 – 2.5 µL volume
Eppendorf Tubes Eppendorf 30125150 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number
Forceps Usbeck FisherScientific 10750313
GELoader Eppendorf Quality Eppendorf 30001222 extruded  tips (0.2 – 20 µL), manufacturer reference number
Magnetic CryoVials Molecular Dimension MD7-402
Microfuge Thermo ThermoFisher Scientific R21
Paper wicks dental2000 64460 Set of paper wicks, multiple retailer
Rotiprotect Nitril-eco  Carl Roth TC14.1 powder free, multiple retailer
SuperClear Plates Jena Bioscience CPL-132 pre-greased plate
UHU super glue UHU GmbH & Co KG 45545 manufacturer reference number, multiple retailer
VeroBlackPlus Alphacam OBJ-40963 manufacturer reference number
XtalTool  Jena Bioscience X-XT-101 sample holder set
XtalTool HT Jena Bioscience X-XT-103 / X-XT-104 SPINE compatible sample holder set
XtalToolBases Jena Bioscience X-XT-105 Magnetic sample holder bases set
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  2. Mac Sweeney, A., D’Arcy, A. A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature. Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).
  3. Kalinin, Y., et al. A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography. Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).
  4. Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).
  5. Pflugrath, J. W. Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures. Methods. 34 (3), 415-423 (2004).
  6. Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
  7. Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).
  8. Martínez-Rodríguez, S., et al. Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).
  9. Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
  10. Teng, T. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  11. Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O’Neill, K., Gillilan, R. Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).
  12. Jian-Xun, Q., Fan, J. An improved loopless mounting method for cryocrystallography. Chinese Physics B. 19 (1), 010601 (2010).
  13. Kitatani, T., et al. New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material. Applied Physics Express. 1 (3), 037002 (2008).
  14. Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).
  15. Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter. Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).
  16. Parkin, S., Hope, H. Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals. Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).
  17. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  18. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5, 10451 (2015).
  19. Roedig, P., et al. Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).
  20. Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).
  21. Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
  22. Feld, G. K., et al. Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).
  23. le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).
  24. Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).
  25. Aller, P., et al. Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).
  26. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).
  27. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  28. Antimonov, M., et al. Large-area Kapton x-ray windows. Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F (2015).
  29. McPherson, A. Penetration of dyes into protein crystals. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).
  30. Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. Raoult’s law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).
  31. Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary?. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).
  32. Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
  33. Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
  34. Yano, O., Yamaoka, H. Cryogenic properties of polymers. Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).
  35. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).

Tags

Macromolecular X-ray CrystallographySample Holder24-well PlateMinimal Background ScatteringCrystal Growth MonitoringCryoprotectionPaper WickCOC FoilPolyimide Foil

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Feiler, C. G., Wallacher, D., Weiss, M. S. An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering. J. Vis. Exp. (149), e59722, doi:10.3791/59722 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image