Minimal arka plan saçılma ile Macromoleküler X-ışını Kristalografi için bir hepsi bir arada örnek tutucu
Summary
Makromoleküler X-ışını Kristalografi için yeni bir örnek tutucu ile birlikte uygun bir kullanım Protokolü sunulmaktadır. Sistem, kristal büyümesi, kristal ıslanmasına ve herhangi bir kristal manipülasyon veya montaj gerek kalmadan her iki, ortam ve kriyojenik sıcaklık içinde situ dikesasyon veri toplama sağlar.
Abstract
Makromoleküler X-ışını Kristalografi (MX), Biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü üç boyutlu bilgisini elde etmek için en belirgin yöntemdir. Yöntem için bir ön koşul, yüksek derecede sipariş edilen kristalin numunesinin incelenmek üzere macromolekül ‘den yetişmek zorunda olduğu, bu da dikeslik deneyi için hazırlıklı olması gerekir. Bu hazırlık prosedürü genellikle kristal, ligand solüsyonu veya Cryo-protectant çözeltisi içinde yetiştirilen ve daha sonra deney için uygun bir Mount üzerinde kristal immobilizing, büyüyen bir çözüm, kristalin kaldırılması içerir. Bu prosedür için ciddi bir sorun makromoleküler kristallerin genellikle mekanik olarak kararsız ve oldukça kırılgan olmasıdır. Sonuç olarak, bu tür kırılgan kristallerin işlenmesi kolayca bir yapı belirlenmesi girişimi bir darboğaz haline gelebilir. Bu tür hassas kristaller için uygulanan herhangi bir mekanik kuvvet moleküllerin düzenli paketleme rahatsız edebilir ve kristallerin kırınım gücü kaybına yol açabilir. Burada, kristallerin işleme adımlarını en aza indirmek ve dolayısıyla yapı belirlenmesi deneyinin başarı oranını maksimize etmek için geliştirilen, tüm-bir-bir örnek tutucu, bir roman sunuyoruz. Örnek tutucu, yaygın olarak kullanılan mikroskop kapak fişi değiştirerek kristal damla kurulumunu destekler. Ayrıca, kristalizasyon boşluğu herhangi bir açılış ve kristal elleçleme olmadan ligand iliklerine, Cryo-koruma ve karmaşık oluşumu gibi yerinde kristal manipülasyon sağlar. Son olarak, örnek tutucu her iki, ortam ve kriyojenik sıcaklık içinde situ X-ışını dikeslik veri toplanması sağlamak için tasarlanmıştır. Bu örnek tutucuyu kullanarak, kristalleşme işleminden kristal veriyle zarar verme şansı, doğrudan kristal elleçleme artık gerekli olmadığından önemli ölçüde azalır.
Introduction
Biyolojik makromoleküllerin üç boyutlu yapısının bilgisi, tüm temel biyolojik, biyokimyasal ve Biyomedikal araştırmalarda önemli bir temel taş oluşturmaktadır. Bu bile bu tür araştırma, örneğin ilaç keşfi gibi belirli translasyonel yönleri uzanır. Atom çözünürlüğünde X-ışını Kristalografi bu tür üç boyutlu bilgi elde etmek için tüm yöntemler arasında en güçlü ve en belirgin biri olduğu gerçeğini tarafından kanıtlanmaktadır ki mevcut tüm yapısal bilgilerin% 90 X-ışını tarafından katkıda bulunulmuştur Kristalografi1. Aynı zamanda büyük bir sınırlama olan X-ışını kristalografinin ana ön koşulu, kırılması kaliteli kristallerin üretilmesi ve dikesleşme deneyi için hazırlanmasıdır. Bu adım hala yöntemin önemli darboğazları birini oluşturmaktadır.
Tarihsel olarak, protein kristallerinin dikeslik verileri ortam sıcaklığında toplandı. Bireysel kristaller dikkatle cam veya kuvars kapillaries veri toplama öncesinde transfer edildi, Anne likör kristaller kuru olmaz ve kapillaries mühürlü olduğunu, böylece kapiller eklendi2,3, 4‘ ü yapın. 1980 ‘ lerden bu yana, X-radyasyon iyonlaştırıcı özellikleri ve makromoleküler kristallerin yakın radyasyon hassasiyeti nedeniyle, ortam sıcaklığında veri toplama yöntemi üzerinde ciddi sınırlamalar teşkil daha belirgin oldu. Sonuç olarak, macromolekül kristalleri 100 K ‘ye kadar soğutarak radyasyon hasar etkilerini azaltmak ve bu kadar düşük sıcaklıkta5,6‘ da dikesleme verileri toplamak için yaklaşımlar geliştirilmiştir. Düşük sıcaklıklarda çalışmak için, numunelerin kapiller içinde montajı düşük ısı transferi oranı nedeniyle pratik hale gelmiştir. Buna rağmen, özellikle karşı difüzyon kristalizasyon deneyleri, düşük sıcaklık kısırlık çalışma7,8, ama, buna bakılmaksızın, kapillaries kullanmak için devam eden çabaları vardır, bu standart oldu ince bir kablolu döngü içinde anne likörü ince bir film tarafından tutulan makromoleküler kristaller monte etmek için makromoleküler Kristalografi yaklaşımı9,10. Bu döngü bazlı montaja zaman içinde bir dizi gelişme (örn. litografik döngüler ve benzeryapıların tanıtımı) zaman içinde yapılmış olsa da, 1990 ‘ ların başlarında geliştirilen temel ilkeler bugün hala kullanımda. Günümüzde makromoleküler kristallerin en fazla kırılacak veri koleksiyonlarının bugün hala bu yaklaşıma güvenmesini güvenli bir şekilde belirtmektedir5.
Zamanla, bazı ilginç yeni gelişmeler ve döngü tabanlı montaj yönteminin modifikasyonları vardı, ama bu yaklaşımlar şimdiye kadar toplumda yaygın olarak kabul edilmedi. Biri, alt arka plan saçılma12,13,14elde etmek için geliştirilen kristallerin sözde döngü daha az montaj olduğunu. Bir diğeri de kristalin örneklerini sarmak ve onları kurumadan korumak için grafen kılıfların kullanımı. Graphene çok düşük X-ışını saçılma arka plan15nedeniyle bu açıdan iyi uygun bir malzemedir.
Daha yakın zamanda, örnek bağlar alanında gelişmeler ağırlıklı olarak örnek verimlilik16 veya birden fazla örnek17, örneğin gibi tutabilir bağlar tasarlama, artan amacı ile bağlar standartlaştırılması üzerinde duruldu Silikon çerçevedeki desenli membranlarda, çoğunlukla seri Kristalografi18, 19,20,21,22alanında yüzlerce küçük kristalleri tutabilen.
Şimdiye kadar tartışılan örnek montaj yöntemlerinin tümü, numuneye mekanik hasara neden olan bir tehlike olduğu anlamına gelen manuel müdahalenin bir derecesini gerektirir. Bu nedenle, örnek ortamın mühendislik tarafından yeni yaklaşımlar aranır, böylece kristallerin kırılıyor verileri büyüme ortamlarında toplanabilir. Bu tür bir yöntem, situ veya plaka-tarama23,24 olarak adlandırılır ve zaten dünya çapında çeşitli senkrotron kaynaklardan makromoleküler Kristalografi beaylines bir dizi uygulanır25. Ancak, bu yöntemin kullanımı kristal plakanın geometrik parametreleri ve aracın örnek noktası etrafında kullanılabilir alan ile sınırlıdır.
Fakat CrystalDirect sistemi26‘ da başka bir yaklaşım gerçekleşir. Burada, tüm kristalizasyon damlaları otomatik olarak hasat edilir. Kristallerin yetiştirdiği folyolar, lazer kullanılarak özel olarak kesilmiş ve doğrudan örnek tutucu27olarak kullanılır.
Burada açıklanan iş, amaç bir örnek tutucusu geliştirmek oldu, hangi bir Kullanıcı dokunmak olmadan veri toplama cihazına kristalin örnek büyüme odasından taşımak için izin verecek ve hangi kullanıcı kolayca örnek manipüle sağlayacak. Makromoleküler Kristalografi alanında birçok araştırmacı, büyük tarama kampanyalarında belirlenen koşulları değiştirerek kristal büyümeyi optimize etmek için 24-iyi kristalizasyon formatını kullandığından, yeni örnek tutucu, Bu formatla uyumludur. Aşağıdaki şekilde, yeni örnek tutucunun tasarımı tarif edilecektir ve işleme ve örnek tutucu içinde situ veri toplama ve ligand ilikleme için performans gösterilecektir. Son olarak, bu yeni örnek sahibinin uygunluğu yanı sıra çeşitli çalışma adımları için sınırlamaları tartışılacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kristalizasyon deneylerine uygunluk. Yeni örnek sahipleri standart asılı damla kristalizasyon deneyler 24-iyi Linbro tip plakaları (türleri 1 ve 2) veya 24-iyi SBS ayak izi plakaları, her iyi bir çapı 18 mm (tip 3) kullanarak kullanılabilir. Standart mikroskop kapak kuponları yerine kullanılabilir. Amorf COC folyo sistemin hava sızdırmazlığını sağlar. Kristalizasyon deneyinin izlenmesi, yüksek netlik folyoları kullanımı nedeniyle bir iletim ışığı mikroskobu kullanılarak mümkündür. Bilgimizin en iyisi için, diğer örnek sahipleri 24-iyi kristalizasyon plakaları için var, hangi kristal manipülasyon veya kırılması deneyler izin verecek, mekanik düşmeden kristal çıkarmadan, hangi o büyüdü. Bu özellikle önem taşımaktadır, çünkü alanda birçok araştırmacı hala kristal optimizasyonu için bu tür plakalar güveniyor, daha büyük damla hacimleri 96 ile karşılaştırıldığında kullanılabilir nedeniyle-iyi oturma-damla plakaları. Bu büyük damla hacimleri ile daha büyük kristaller elde edilebilir.
Kristal manipülasyon uygunluğu. Dış COC folyo ve iç sarı poliimid folyo mikrogözenekli yapısı kendi kendine iyileştirici özellikleri nedeniyle, kristal çevre erişilebilir ve kristaller mekanik olarak diğer konteynerlere transfer olmadan manipüle edilebilir. Bu örnek sahipleri çok uygun hale getirir. Kristale Bu dolaylı ve nazik erişim sağlayan bildiğimiz tek sistem, CrystalDirect sistemi26‘ dir. Ancak, CrystalDirect özel 96-iyi kristalizasyon plakaları kullanılması gerektiğinden daha az esnektir. Kristallerin büyüyen folyo, kristalizasyon deneyi mühürler ve kendini iyileştirme değildir aynıdır. Bu, kristaller için ligor veya Cryo-protektan teslim için lazer ablasyon tarafından folyo içine delinmiş olan bir diyafram açık kalacaktır, sıvı buharlaşma şansını artırarak anlamına gelir. Bu bizim tasarım aksine, nerede kristaller doğrudan çevreye maruz olmayacaktır bile COC folyo zaman bir dizi deldi alır.
Ortam sıcaklığında in situ dikeslik deneylerinin uygunluğu. Örnek tutucu, kristalizasyon plakasının düz ileri bir şekilde çıkarılabilir, bir manyetik baz üzerine sıkışmış ve bir Beam hattı Goniometer koymak. Oda sıcaklığında bir kırılması deneyi için, örnek tanımlanan nem33bir hava akışına koymak tavsiye edilir. Kristalin etrafında anne likör arka plan saçılma azaltmak için Goniyometre örnek tutucu koyarak önce kaldırılabilir. Böyle bir set-up saatler için kararlı.
100 K. ‘ de kullanım ve depolama için kullanılan malzemenin uygunluğu. Ne numune tutucu ne de poliimid film üretimi için kullanılan malzeme düşük sıcaklıklarda34onları soğutarak olumsuz etkilenir. Bu nedenle, düşük sıcaklıkta örnek tutucu ile çalışma (örneğin, 100 K) ciddi bir sorun teşkil etmez.
100 K. ‘ de situ kırınım deneylerinin uygunluğu 100 K ‘de bir nitrojen akışında veri toplama için, örnek tutucu bir önceki paragrafta olduğu gibi kristalizasyon plakasının çıkarılması gerekir, bir manyetik baz üzerine sıkışmış ve bir gazlı nitrojen akışı içine koymak 100 K bir Beam hattı Goniometer üzerinde. İstenirse, örnek de Cryo korumalı olabilir, ancak büyük olasılıkla bu çıplak örnekler için bu gerekli olmayabilir çoğu durumda31. 100 K ‘de deneyler için, dış plastik yüzük çıkarıldığından, örnek tutucular tip 2 ve 3 daha uygundur. Bu nedenle, daha küçük boyutta ve bu nedenle daha az buzlanma eğilimli olmalıdır. Ancak, tip 1 bile bir örnek sahibi kullanılabilir. Deneysel barakada bir çok yüksek nem ve tutucunun düzgün hizalanmış Cryo-sistemi buzlanma gerçekten bir sorun değildir.
Sınırlamalar. Örnek tutucu geometrisi, 160 ° ‘ lik toplam döndürme aralığı üzerinden dönme yöntemine göre engelsiz kırkın veri toplamasını sağlar. Çoğu kristal sistem için tam kırılacak veri kümeleri elde edilebilir, böylece bu yeterlidir. Bu mümkün olmadığı durumlarda, kristal daha fazla veri birlikte birleştirilmesi gerekir. Kristaller bir araya geldiğinde, olay X-ışını ışını boyutunu ayarlamak mümkün olabilir, böylece bireysel kristallerin sadece parçaları maruz kalır. Aşırı durumlarda, bir veri toplama stratejisi MeshAndCollect yaklaşımı35benzer başvurmak gerekebilir. Özetle, örnek sahipleri ile ilişkili belirli sınırlamalar varken, bunlar çoğu durumda üstesinden gelebilir. Tabii ki, bu durumların hiçbiri mümkün değildir karşılaşılan her zaman mümkündür. Bu gibi durumlarda, bir diğer kristal montaj yöntemleri başvurmak gerekebilir.
Macromoleküler Kristalografi için örnek tutucu yeni bir tip tarif ettik ve biz çeşitli uygulamalar için numune sahipleri uygunluğu göstermiştir. Protein kristallerinin basit ve tekrarlanabilir şekilde işlenmesini ve örnek sahiplerinin benzersiz özelliklerini dikkate alarak, bu örnek sahiplerinin makromoleküler için numune sahiplerinin cephaneliği için değerli bir ek olduğunu kanıtlayacağı inanıyoruz. Kristalografi.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar BESSY II, Helmholtz-Zentrum Berlin tarafından kiriş zaman erişim ve destek için işletilen teşekkür etmek istiyorum, ve tasarım ve inşaat ve 3D-yazıcı tesisleri erişimi ile yardım için örnek çevre ve teknik tasarım bölümleri.
Materials
| AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
| Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
| COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
| ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
| Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
| Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 – 2.5 µL volume |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
| Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
| GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 – 20 µL), manufacturer reference number |
| Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
| Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
| Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
| Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
| SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
| UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
| VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
| XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
| XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
| XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |
References
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Mac Sweeney, A., D’Arcy, A. A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature. Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).
- Kalinin, Y., et al. A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography. Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).
- Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).
- Pflugrath, J. W. Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures. Methods. 34 (3), 415-423 (2004).
- Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
- Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).
- Martínez-Rodríguez, S., et al. Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).
- Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
- Teng, T. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
- Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O’Neill, K., Gillilan, R. Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).
- Jian-Xun, Q., Fan, J. An improved loopless mounting method for cryocrystallography. Chinese Physics B. 19 (1), 010601 (2010).
- Kitatani, T., et al. New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material. Applied Physics Express. 1 (3), 037002 (2008).
- Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).
- Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter. Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).
- Parkin, S., Hope, H. Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals. Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).
- Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5, 10451 (2015).
- Roedig, P., et al. Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).
- Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).
- Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
- Feld, G. K., et al. Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).
- Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).
- Aller, P., et al. Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).
- Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).
- Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
- Antimonov, M., et al. Large-area Kapton x-ray windows. Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F (2015).
- McPherson, A. Penetration of dyes into protein crystals. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).
- Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. Raoult’s law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).
- Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary?. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
- Yano, O., Yamaoka, H. Cryogenic properties of polymers. Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).
