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Biochemistry

Ein All-in-One-Probenhalter für makromolekulare Röntgenkristallographie mit minimaler Hintergrundstreuung

Published: July 06, 2019
doi:
10.3791/59722
, ,
1Macromolecular Crystallography (HZB-MX),Helmholtz-Zentrum Berlin, 2Department Sample Environment,Helmholtz-Zentrum Berlin

Summary

Ein neuartiger Probenhalter für die makromolekulare Röntgenkristallographie wird zusammen mit einem geeigneten Handhabungsprotokoll vorgestellt. Das System ermöglicht die Kristallwachstum, Kristalleinweichung und in situ Beugungsdatenerfassung bei sowohl Umgebungs- als auch kryogener Temperatur, ohne dass Kristallmanipulationen oder -montage erforderlich sind.

Abstract

Die makromolekulare Röntgenkristallographie (MX) ist die prominenteste Methode, um hochauflösende dreidimensionale Kenntnisse über biologische Makromoleküle zu erlangen. Voraussetzung für das Verfahren ist, dass aus dem zu untersuchenden Makromolekül hochgeordnete kristalline Proben angebaut werden müssen, die dann für das Beugungsexperiment vorbereitet werden müssen. Dieses Zubereitungsverfahren beinhaltet in der Regel das Entfernen des Kristalls aus der Lösung, in der er angebaut wurde, das Einweichen des Kristalls in Ligandenlösung oder kryoschützende Lösung und anschließendes Immobilisieren des Kristalls auf einer für das Experiment geeigneten Halterung. Ein ernstes Problem für dieses Verfahren ist, dass makromolekulare Kristalle oft mechanisch instabil und ziemlich zerbrechlich sind. Folglich kann der Umgang mit solchen zerbrechlichen Kristallen leicht zu einem Engpass bei einem Strukturfeststellungsversuch werden. Jede mechanische Kraft, die auf solche empfindlichen Kristalle angewendet wird, kann das regelmäßige Verpacken der Moleküle stören und zu einem Verlust der Beugungskraft der Kristalle führen. Hier stellen wir einen neuartigen All-in-One-Probenhalter vor, der entwickelt wurde, um die Handhabungsschritte von Kristallen zu minimieren und damit die Erfolgsrate des Strukturbestimmungsexperiments zu maximieren. Der Probenhalter unterstützt die Einrichtung von Kristalltropfen, indem er die häufig verwendeten Mikroskopabdeckungsscheine ersetzt. Darüber hinaus ermöglicht es in-Place-Kristallmanipulation wie Ligandeneinweichen, Kryoschutz und komplexe Bildung ohne Öffnung der Kristallisationshöhle und ohne Kristallhandhabung. Schließlich wurde der Probenhalter so konzipiert, dass die Erfassung von In-situ-Röntgenbeugungsdaten sowohl bei Umgebungstemperatur als auch bei kryogener Temperatur ermöglicht wird. Durch die Verwendung dieses Probenhalters werden die Chancen, den Kristall auf dem Weg von der Kristallisation zur Beugungsdatenerfassung zu beschädigen, erheblich reduziert, da keine direkte Kristallhandhabung mehr erforderlich ist.

Introduction

Die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur biologischer Makromoleküle stellt einen wichtigen Eckpfeiler in der gesamten biologischen, biochemischen und biomedizinischen Grundlagenforschung dar. Dies erstreckt sich sogar auf bestimmte translationale Aspekte dieser Forschung, wie z. B. die Entdeckung von Arzneimitteln. Unter allen Methoden zur Erlangung solcher dreidimensionaler Informationen bei der atomaren Auflösung ist die Röntgenkristallographie die stärkste und prominenteste, wie die Tatsache zeigt, dass 90% aller verfügbaren Strukturinformationen durch Röntgenbeigesteuerte Kristallographie1. Die wichtigste Voraussetzung für die Röntgenkristallographie, die gleichzeitig ihre Hauptbeschränkung darstellt, ist, dass Kristalle in Beugungsqualität hergestellt und für das Beugungsexperiment vorbereitet werden müssen. Dieser Schritt stellt nach wie vor einen der größten Engpässe der Methode dar.

Historisch gesehen wurden Beugungsdaten von Proteinkristallen bei Umgebungstemperatur gesammelt. Einzelne Kristalle wurden vor der Datenerhebung sorgfältig in Glas- oder Quarzkapillaren übertragen, Mutterlikör wurde den Kapillaren zugesetzt, damit die Kristalle nicht austrocknen und die Kapillaren versiegelt werden2,3, 4. Seit den 1980er Jahren wurde immer deutlicher, dass aufgrund der ionisierenden Eigenschaften der X-Strahlung und der unmittelbar bevorstehenden Strahlenempfindlichkeit von makromolekularen Kristallen die Datenerfassung bei Umgebungstemperatur starke Einschränkungen für die Methode darstellt. Folglich wurden Ansätze entwickelt, um Strahlungsschäden durch Kühlung makromolekularer Kristalle auf 100 K zu mildern und Beugungsdaten bei solch niedriger Temperatur5,6zu sammeln. Für die Arbeit bei niedrigen Temperaturen wurde die Montage der Proben in Kapillaren aufgrund der geringen Wärmeübertragungsrate unpraktisch. Trotzdem gibt es laufende Bemühungen, auch Kapillaren, insbesondere aus Antidiffusionskristallisationsexperimenten, für Niedertemperaturbeugungsarbeiten7,8, zu verwenden, aber unabhängig davon wurde sie zur Norm Ansatz in der makromolekularen Kristallographie, um makromolekulare Kristalle zu montieren, die von einem dünnen Film von Mutterlauge in einer dünnen drahtgebundenen Schleife gehalten werden9,10. Auch wenn im Laufe der Zeit eine Reihe von Verbesserungen (z.B. die Einführung von lithographischen Schleifen und ähnlichen Strukturen11) an dieser schleifenbasierten Montage vorgenommen wurden, werden die Grundprinzipien, die Anfang der 1990er Jahre entwickelt wurden, auch heute noch verwendet. Es kann mit Sicherheit festgestellt werden, dass die meisten Beugungsdatensammlungen auf makromolekularen Kristallen heutzutage noch immer auf diesem Ansatz basieren5.

Im Laufe der Zeit gab es einige interessante neue Entwicklungen und Modifikationen der schleifenbasierten Montagemethode, aber diese Ansätze wurden in der Community bisher nicht weit verbreitet. Eine davon ist die sogenannte schleifenlose Montage von Kristallen, die entwickelt wurde, um eine niedrigere Hintergrundstreuung12,13,14zu erreichen. Ein weiteres ist die Verwendung von Graphenscheiden, um die kristallinen Proben zu wickeln und sie vor dem Austrocknen zu schützen. Graphen ist in dieser Hinsicht ein geeignetes Material, da es sehr wenig Röntgenstreuhintergrund15ist.

In jüngerer Zeit konzentrierten sich die Entwicklungen auf dem Gebiet der Probenhalterungen hauptsächlich auf die Standardisierung der Halterungen mit dem Ziel, den Probendurchsatz16 zu erhöhen, oder auf die Konstruktion von Halterungen, die mehr als eine Probe17aufnehmen können, wie z. B. gemusterte Membranen auf einem Siliziumrahmen, die in der Lage sind, Hunderte von kleinen Kristallen vor allem im Bereich der seriellen Kristallographie18,19,20,21,22zu halten.

Alle bisher diskutierten Probenmontagemethoden erfordern noch ein gewisses Maß an manuellem Eingriff, was bedeutet, dass die Gefahr besteht, dass die Probe mechanisch beschädigt wird. Daher werden neue Ansätze gesucht, indem die Stichprobenumgebung so erdneuert wird, dass Beugungsdaten von Kristallen in ihrer Wachstumsumgebung gesammelt werden können. Eine solche Methode wird in situ oder Plattenscreening23,24 und es ist bereits an einer Reihe von makromolekularen Kristallographie Strahllinien an verschiedenen Synchrotronquellen weltweit implementiert25. Die Verwendung dieser Methode wird jedoch durch die geometrischen Parameter der Kristallplatte und den um den Probenpunkt des Instruments verfügbaren Raum begrenzt.

Ein weiterer Ansatz wird im sogenannten CrystalDirect-System26realisiert. Hier werden ganze Kristallisationstropfen automatisch geerntet. Die Folien, auf denen die Kristalle angebaut wurden, werden mit einem Laser maßgeschneidert und direkt als Probenhalter27verwendet.

In der hier beschriebenen Arbeit ging es darum, einen Probenhalter zu entwickeln, der es dem Benutzer ermöglichen würde, die kristalline Probe von seiner Wachstumskammer auf das Datenerfassungsgerät zu verschieben, ohne sie zu berühren, und die es dem Benutzer ermöglichen würde, die Probe leicht zu manipulieren. Da viele Forscher auf dem Gebiet der makromolekularen Kristallographie immer noch das 24-Well-Kristallisationsformat zur Optimierung des Kristallwachstums verwenden, indem sie die in großen Screening-Kampagnen identifizierten Bedingungen verändern, wurde der neue Probenhalter als kompatibel mit diesem Format. Im Folgenden wird das Design des neuen Probenhalters beschrieben und die Handhabung und Leistung des Probenhalters für die In-situ-Datenerfassung und das Einweichen von Liganden demonstriert. Schließlich werden die Eignung dieses neuen Probenhalters sowie seine Grenzen für die verschiedenen Arbeitsschritte erörtert.

Protocol

VORSICHT: Bei allen nachfolgenden Arbeiten ist es sehr wichtig, dass die gelb gefärbte Polyimidfolie wegen möglicher Verunreinigungen des Probenhalters nicht mit ungeschützten Fingern berührt wird. Auch die Verwendung von geschützten Zangen ist sehr zu empfehlen. 1. Der Probenhalter Verwenden Sie einen der drei Arten von Probenhaltern.HINWEIS: In Abbildung 1sind drei verschiedene Versionen des neu entwickelten Probenhalters dargestellt. Alle enthalten eine schwarze Kunststoffträgerstruktur, eine luftdichte COC-Folie auf der Außenseite und eine mikroporöse strukturierte Polyimidfolie auf der Innenseite. Typ 1 (Abbildung 1A) enthält einen festen äußeren Kunststoffring, während bei den Typen 2 und 3 (Abbildung 1B,1C) der Äußere Ring mechanisch an den vorgesehenen jeweiligen Bruchstellen für den Einsatz in automatisierten Probenübertragungssystemen abgebrochen werden kann (siehe rot Pfeile in Abbildung 1B). Das Design der Probenhalter ermöglicht die Einrichtung mehrerer Kristallisationstropfen auf der gelben Polyimidfolie. Die Überwachung des Kristallisationsexperiments wird dadurch nicht beeinträchtigt, da das Material für sichtbares Licht hochtransparent ist. Die 21 m dicke Polyimidfolie verfügt zudem über 5 m Poren, die eine einfache Kristallmanipulation durch späteres Einweichen ermöglichen. Da die Übertragung von Röntgenstrahlen bei allen gängigen Beugungsdatenerfassungsenergien in der makromolekularen Kristallographie nahe 1,0 liegt, ist der Beitrag der Folie zur Hintergrundstreuung in einem Beugungsexperiment vernachlässigbar28. 2. Einrichten von Kristallisationstropfen Erstellen Sie eine saubere und staubfreie Oberfläche mit einem feuchten fusselfreien Tuch. Nehmen Sie einen Probenhalter aus der Box und legen Sie ihn vorsichtig, gelbe Folie nach oben, auf die gereinigte Oberfläche, um Beschädigungen oder unerwünschte Einstiche der HINTERen COC-Folie zu vermeiden. Richten Sie die Kristallisationstropfen mit einem maximal empfohlenen Volumen von 2 l auf der gelben Folie ein, wie es auf häufig verwendeten Deckschlitten der Fall wäre. Legen Sie die Tropfen vorsichtig, um einen Bruch oder Piercing der Folie mit einer Pipette zu vermeiden. Auf einem Probenhalter vom Typ 1 (Abbildung 2A) können bis zu drei Tropfen platziert werden, während auf Probenhaltern des Typs 2 und 3 zwei Tropfen die empfohlene Obergrenze sind (Abbildung 2C). Drehen Sie den Probenhalter um und legen Sie ihn auf einen vorgefetteten Hohlraum einer 24-Well Linbro-Platte. Verwenden Sie die Positionierhilfen (siehe rote Pfeile in Abbildung 1A) des Probenhalters, um ihn an seine optimale Position zu führen. Stellen Sie die korrekte Position des Probenhalters sicher, um unerwünschte Verdunstung zu vermeiden (Abbildung 2A). 3. Beobachten des Kristallwachstums Durch Platzieren der Kristallisationsplatte unter einem Transmissionslichtmikroskop, mit oder ohne Polarisatoren, überwachen Sie das Kristallwachstum ohne Störung des Experiments (Abbildung 4). Verwenden Sie bei Verwendung der kleineren 18-mm-Probenhalter vom Typ 3 (Abbildung 1C), die für den Einsatz auf SBS-Footprint-Platten entwickelt wurden, einen Bildgebungsroboter ein, der SBS-Footprint-Platten verarbeiten kann, um das Kristallwachstum automatisierter zu überwachen. 4. Kristallmanipulation HINWEIS: Es wird empfohlen, alle nachfolgenden Schritte unter einem Transmissionslichtmikroskop durchzuführen. Kryo-Schutz Durchbohren Sie die äußere COC-Folie vorsichtig mit einer feinen Kanüle. Stellen Sie sicher, dass die innere gelbe Folie unberührt bleibt. Die Punktion sollte sich direkt neben dem Tropfen begeben, der manipuliert werden soll (Abbildung 3A,3C). Verwenden Sie einen feinen Papierdocht und legen Sie ihn in das Loch ein. Schieben Sie den Docht vorsichtig nach vorne, bis er die gelbe Polyimidfolie berührt. Halten Sie den Docht in Kontakt mit der perforierten Folie. Der Docht saugt alle überschüssigen Lösungen weg. Die Zeit, die für die vollständige Flüssigkeitsentfernung benötigt wird, hängt von der Viskosität der Lösungen und der Zusammensetzung der Mutterlauge ab (Abbildung 3B). Nachdem alle Flüssigkeit weggesaugt wird, ziehen Sie vorsichtig den Papierdocht zurück. Denken Sie an die Position des Tropfens, da er nach dem Entfernen des Mutterlikörs möglicherweise nicht sichtbar ist. Nehmen Sie eine Standardpipette, um ein kleines Volumen an kryoschützender Lösung aufzutragen, max. 3 l, mit einer extrudierten Spitze (z. B. einer Gel-Ladespitze) durch dasselbe Loch. Sobald die Flüssigkeit abgegeben ist, ziehen Sie die Spitze ein. Die Porosität der gelben Folie ermöglicht die Diffusion über die Folie. Die Zeit, um den Kryoschutz Ihrer Kristalle zu erreichen, hängt stark von der verwendeten Lösung und ihren Komponenten ab. Um die selbstheilende COC-Folie wieder zu versiegeln, legen Sie vorsichtig einen geschützten Finger für ca. 1 s auf das Loch und schieben Sie ihn über die Punktion. Der leichte Druck in Kombination mit der erhöhten Temperatur fördert die Wiederversiegelung von Punktionen, die nicht zu groß sind. Ligand-EinweichungHINWEIS: Überschüssige Mutterlikör kann vor dem Einweichen von Ligand entfernt werden. Führen Sie hierzu die in 4.1.1 bis 4.1.3 beschriebenen Schritte aus. Lösen Sie den Liganden in Mutterlauge in der gewünschten Konzentration in einem Reaktionsrohr. Drehen Sie die Lösung 10 Minuten bei 12.000 x g, um unlösliche Partikel zu entfernen. Verwenden Sie bei Bedarf eine temperaturgeregelte Zentrifuge. Legen Sie vorsichtig ein Volumen von max. 3 L Ligand enthaltende Lösung im Spalt zwischen der COC-Folie und der Polyimidfolie mit einer langen, extrudierten Pipetspitze. Ziehen Sie die Spitze zurück. Um die selbstheilende COC-Folie wieder zu versiegeln, legen Sie einen geschützten Finger für ca. 1 s vorsichtig auf das Loch und schieben Sie ihn über die Punktion (siehe auch 4.1.5). Inkubieren Sie das Experiment für einige Zeit, um eine Diffusion über die Membran zu ermöglichen. Die Einweichzeit hängt stark von der Viskosität der Streulösung und ihrer Komponentenab 29. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1 bis 4.2.5 mehrmals, um anschließend verschiedene Liganden einzuweichen. 5. In-situ-Beugungsdatenerfassung bei Umgebungstemperatur HINWEIS: Um die Lösungsmittelstreuung zu minimieren, entfernen Sie überschüssige Lösung vor der Datenerfassung. Stellen Sie eine stabile feuchtigkeitsgesteuerte Beamline-Umgebung mit vorgegebenen Bedingungen30sicher. Heben Sie die transparente COC-Folie vorsichtig an der vorgesehenen Stelle mit Zangen an und schälen Sie sie ab, als würde man den Deckel aus einer Joghurttasse entfernen ( Abbildung 6B). Heben Sie den Probenhalter vorsichtig aus seinem Hohlraum und legen Sie ihn sofort in eine vorgefertigte magnetische Probenhalterbasis ein. Für diesen Schritt ist kein Kleber erforderlich (Abbildung 6B). Tragen Sie sanften Druck auf, um die korrekte Positionierung des Probenhalters innerhalb der Basis zu gewährleisten. Montieren Sie den Probenhalter auf einem Beamline-Goniometer und sorgen Sie für eine korrekte Positionierung des Halters. Je nach Goniometergeometrie kann der Probenhalter um bis zu 160° gedreht werden, ohne dass während des Beugungsexperiments Schatten verursacht wird. Verwenden Sie einen Papierdocht und berühren Sie vorsichtig die gelbe Polyimidfolie von der Rückseite, um überschüssige Mutterlauge zu entfernen. Bitte beachten Sie, dass in diesem Stadium Ligandeneinweichung oder Kryoschutz genauso gut durchgeführt werden kann. Die Stichprobe ist nun für die Zentrierung und Beugungsdatenerfassung bereit. Wenn Sie einen Probenhalter mit abnehmbarem Außenring verwenden, wenden Sie sanften Druck an, indem Sie ihn am äußeren Ring festhalten und brechen Sie ihn an den vorgesehenen Bruchstellen ab (Abbildung 6C). Die Stichprobe ist nun für die Zentrierung und Beugungsdatenerfassung bereit. 6. Insitu-Beugungsdatenerhebung bei kryogener Temperatur HINWEIS: Es wird empfohlen, Restmutterlauge aus der Probe zu entfernen, indem die Schritte 4.1.1 ausgeführt werden. bis 4.1.3. bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren, um die Lösungsmittelstreuung zu minimieren. Die meisten Proben können ohne vorherigen Kryoschutz31in flüssigen Stickstoff übertragen werden. Wenn Kryoschutz erforderlich ist, siehe Schritte 4.1.1. bis 4.1.5. Heben Sie die COC-Folie an der vorgesehenen Stelle vorsichtig mit einer Zange an und ziehen Sie sie ab (siehe Schritt 5.1.2) (Abbildung 6A). Nehmen Sie den Probenhalter aus dem Hohlraum und montieren Sie ihn auf einer magnetischen Probenhalterbasis. Um eine korrekte und enge Montage zu gewährleisten, kann sanfter Druck ausgeübt werden (siehe Schritt 5.1.5, Abbildung 6B).HINWEIS: Die symmetrisch angeordneten Haltepunkte ermöglichen eine einfache Entfernung des äußeren Rings des Probenhalters durch sanften Druck (siehe Schritt 5.1.8., Abbildung 6C). Jetzt ist der Probenhalter fertig und kann in flüssigen Stickstoff getaucht werden. Die Geometrie der Probenhaltertypen 2 und 3 (Abbildung 1B,1C) ermöglicht deren Übertragung in Standard-SPINE-Probenfläschchen, die für die roboterunterstützte Probenmontage verwendet werden können (Abbildung 6D).

Representative Results

Der Probenhalter Typ 1 ist so konzipiert, dass er auf einen Brunnen einer 24-Well Linbro-Platte passt. Jeder einzelne Probenhalter enthält Positionierhilfen auf beiden Seiten der Außenfelge, um eine optimale Positionierung am Rand des Brunnens zu gewährleisten (Abbildung 1A, Abbildung 2A). Auf die gelbe Polyimidfolie (Abbildung2B)können bis zu drei einzelne Kristallisationstropfen mit einem maximalen Volumen von je 2 l gelegt werden. Für Probenhalter der Typen 2 und 3 wird empfohlen, maximal zwei Tropfen mit einem maximalen Volumen von 2 l festzulegen. 24 Probenhalter können auf eine 24-Well-Linbro-Platte montiert werden (Abbildung 3D). Ein Kristallisationsexperiment auf einer 24-Well-Linbro-Platte mit Probenhalter Typ 1 wurde eingerichtet. 1 L Der Hen-Ei-Weiß-Lysozym-Lösung (15 mg/ml) wurde mit 1 l Mutterlauge gemischt, die 50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl und 25% (w/v) PEG-6000 auf der gelben Polyimidfolie auf dem Probenhalter (Tabelle1) umfasst. Der Rückgang wurde bei 293 K gegen 500 l Mutterlauge ausgeglichen und Kristalle der Größe 40-50 m wurden nach 5 Stunden beobachtet (Abbildung4). Das Kristallwachstum kann mit einem Transmissionslichtmikroskop (Abbildung 4) mit oder ohne Polarisator beobachtet werden. Hochintransparenzfolien gewährleisten eine optimale Beobachtung und Überwachung der Kristallwachstumsbedingungen mit einem konventionellen Lichtmikroskop oder einem automatisierten Kristallbildgebungssystem. Die Kristallwachstumsbeobachtung mit UV-Licht wurde nicht getestet. Nach dem Entfernen des Mutterlikörs aus den Kristallen wurde ein Probenhalter mit Hühnerei-weißen Lysozymkristallen von der Kristallisationsplatte entnommen und in einen feuchtigkeitsgeregelten Luftstrom auf HZB-MX-Beamline 14.332gelegt. Beugungsdaten wurden bei Umgebungstemperatur in 1°-Schritten mit einem 150-mm-Strahl bei 13,8 keV-Energie mit 4 x 1010 Photonen/s und einer Belichtungszeit von 5 s pro Bild erhoben. Ein typisches Beugungsbild ist in Abbildung 5dargestellt. Es kann keine erhöhte Hintergrundstreuung auf dem Beugungsbild erkannt werden. Weitere experimentelle Details sowie die zugehörigen Datenverarbeitungsstatistiken sind in Tabelle 2aufgeführt. Abbildung 1 : Schematische Ansicht der neuen Probenhalter. Die Probenhalter bestehen aus einer schwarzen Kunststoffstütze, die an der Außenseite mit einer amorphen zyklischen Olefin-Copolymer-Folie (COC) bedeckt ist. Diese Folie (blau gefärbt) ist hochtransparent und selbstheilend. Es sorgt auch für die Dichtheit des Experiments. Die Innenfolie (gelb gefärbt) besteht aus bioinertem Polyimid, das für Röntgenstrahlen hochtransparent ist. Auf diese Folie können die Kristallisationstropfen platziert werden. Der äußere Rand des Probenhalters enthält zwei Positionierhilfen, die durch den roten Pfeil (Panel A) gekennzeichnet sind, was eine genaue Platzierung des Probenhalters auf dem einzelnen vorgefetteten Hohlraum der Kristallisationsplatte ermöglicht. (A) Probenhalter (Typ 1) mit 22 mm Durchmesser mit festem außenseitigen Stützring. (B) Probenhalter (Typ 2) mit 22 mm Durchmesser mit abnehmbarem außenseitig. (C) Probenhalter (Typ 3) mit 18 mm Durchmesser mit abnehmbarem außenseitig. Die beiden letztgenannten wurden für den Einsatz in hochdurchsatzweise mit automatisierten Probenmontagerobotern nach SPINE-Standard entwickelt. Die markierten Haltepunkte werden durch die roten Pfeile in Panel Bhervorgehoben. Der schwarze Pfeil in Panel C zeigt die Positionierungsmarkierung an. Die hervorstehenden Stifte am äußeren Rand der gelben Folie sind notwendig, um die Polyimidfolie während des Produktionsprozesses auszurichten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2 : Der Probenhalter kann auf einer 24-Well-Linbro-Platte auf die gleiche Weise verwendet werden wie die häufig verwendeten Mikroskopabdeckungsscheine. Es versiegelt den Hohlraum luftdicht. Positionierhilfen sorgen für die korrekte Positionierung des Probenhalters auf dem Hohlraum (rote Pfeile in Panel A). Bis zu drei einzelne Tropfen können auf einen Probenhalter typ 1 (Panel B)gelegt werden, während die empfohlene maximale Anzahl von Tropfen, die auf einen Probenhalter vom Typ 2 oder 3 gelegt werden, zwei beträgt. Das maximale empfohlene Volumen für jeden Tropfen beträgt 2 l. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3 : 24 Typ-1-Probenhalter passen auf eine 24-Well-Platte. Die Probenhalter können wie angegeben in zwei Ausrichtungen auf der 24-Well-Platte platziert werden (Panel D). Eine Kanüle wird verwendet, um die hintere COC-Folie zu durchbohren, um überschüssige Lauge aus einem Kristallisationstropfen (Platten A und C) zu entfernen, indem ein Papierdocht verwendet wird, der sanft in das gleiche Loch (Panel B)eingesetzt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4 : Bild von Hühnerei-weißen Lysozymkristallen, die durch ein Übertragungsmikroskop beobachtet werden, das mit einem Polarisator ausgestattet ist. Einzelne Kristalle lassen sich leicht von der gefällten Proteinlösung unterscheiden. Die Kristalle in diesem Bild haben eine durchschnittliche Größe von 40 x 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.  Abbildung 5 : Ein typisches Röntgenbeugungsbild eines Lysozymkristalls, der auf dem Probenhalter angebaut wird. Vor der Exposition gegenüber Röntgenstrahlen wurde alle überschüssigen Mutterlauge aus der Umgebung des Kristalls entfernt. Beugungsdaten wurden bei Umgebungstemperatur auf BL14.3 am Elektronenspeicherring BESSY II32 unter Verwendung einer feuchtigkeitsgesteuerten Probenumgebung mit 97,5 % relativer Luftfeuchtigkeit erhoben. Es ist kein erhöhter Hintergrund aufgrund der Probenhalter zu beobachten. Die gestrichelten Linien im Bild zeigen die Auflösungsringe an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6 : Der Probenhalter ist für die Erfassung von Beugungsdaten vorbereitet. Zuerst wird die COC-Folie mit einer Zange sanft angehoben und dann abgeschält (Panel A). Anschließend wird der Probenhalter aus dem Hohlraum entfernt und in das zentrale Loch einer magnetischen Basis eingeführt, bis er durch den Marker (Panel B) angezeigt wird. Durch Festhalten am Mittelteil wird sanfter Druck auf den Äußeren Ring ausgeübt, um den Mittelteil mit den symmetrisch angeordneten Bruchpunkten (Panel C) zu befreien. Nach der Entnahme kann der Probenhalter in flüssigen Stickstoff getaucht und in Standard-SPINE-Fläschchen übertragen werden. Platziert, zum Beispiel, in Pucks können sie zu Synchrotron-Standorten transportiert werden, wo automatisierte ProbenmontageRoboter erkennen sie als regelmäßige Proben (Panel D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.  Kristallisationsdetails system Hängender Tropfen, Dampfdiffusionsmethode Plattentyp SuperClear Platten Temperatur (K) 293 Proteinkonzentration (mg ml-1) 15 Zusammensetzung der Reservoirlösung 50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl, 25 % (w/v) PEG-6000 Volumen und Verhältnis des Tropfens 2 l gesamt, 1:1 Verhältnis (Protein : Mutterlikör Volumen des Reservoirs 500 l Inkubationszeit 12 Stunden Tabelle 1: Experimentelle Details des beschriebenen Kristallisationsexperiments. Datenerhebung und -verarbeitung Wellenlänge () 0,89429 Temperatur (K) 293 detektor Rayonix MX225 CCD Kristalldetektorabstand (mm) 120 Rotationsbereich pro Bild (°) 0,5 Gesamtrotationsbereich (°) 120 Belichtungszeit pro Bild (s) 5 Weltraumgruppe P43212 Einheiten-Zell-Parameter (A) a = 79,01, b = 79,01, c = 37,95 Mosacity (°) 0,07 Auflösungsbereich (A) 39,50 – 1,35 (1,37 – 1,35) Gesamtzahl der Reflexionen 191940 (8932) Anzahl der eindeutigen Reflexionen 27020 (1292) Vollständigkeit (%) 99,88 (99,20) vielzahl 7.1 (6.9) Mittelwert I/A(I) 15,0 (1,9) R-Meas35 (%) 6,3 (107,0) Rpim36 (%) 2.4 (40,4) CC1/237  99,9 (68,5) ISa38 16.1 Wilson B-Faktor(2 ) 17,0 Tabelle 2: Erhebungs- und Verarbeitungsstatistiken für Beugungsdaten.

Discussion

Eignung für Kristallisationsexperimente. Die neuen Probenhalter können für Standard-Hangtropfenkristallisationsexperimente mit 24-Well-Linbro-Typenplatten (Typen 1 und 2) oder 24-Well-SBS-Fußabdruckplatten verwendet werden, bei denen jeder Brunnen einen Durchmesser von 18 mm hat (Typ 3). Sie können anstelle der Standard-Mikroskopabdeckungsscheine verwendet werden. Die amorphe COC-Folie sorgt für die Luftdichtheit des Systems. Die Überwachung des Kristallisationsexperiments ist durch den Einsatz von Hochklarheitsfolien mit einem Transmissionslichtmikroskop möglich. Nach bestem Wissen und Gewissen gibt es keine anderen Probenhalter für 24-Well-Kristallisationsplatten, die Kristallmanipulationen oder Beugungsexperimente ermöglichen würden, ohne den Kristall mechanisch aus dem Tropfen zu entfernen, in dem er angebaut wird. Dies ist von besonderer Bedeutung, da viele Forscher auf diesem Gebiet immer noch auf solche Platten für die Kristalloptimierung angewiesen sind, da größere Tropfenvolumina im Vergleich zu 96-well-Sitztropfenplatten verwendet werden können. Mit diesen größeren Tropfenvolumen können größere Kristalle gewonnen werden.

Eignung für Kristallmanipulation. Durch die selbstheilenden Eigenschaften der äußeren COC-Folie und die mikroporöse Struktur der inneren gelben Polyimidfolie ist die Kristallumgebung zugänglich und die Kristalle können manipuliert werden, ohne sie mechanisch auf andere Behälter zu übertragen. Das macht die Probenhalter sehr bequem. Das einzige andere System, das wir kennen, das diesen indirekten und sanften Zugang zum Kristall ermöglicht, ist das CrystalDirect-System26. CrystalDirect ist jedoch weniger flexibel, da spezielle 96-Well-Kristallisationsplatten verwendet werden müssen. Die Folie, auf der die Kristalle wachsen, ist die gleiche, die das Kristallisationsexperiment besiegelt und sie ist keine Selbstheilung. Dies bedeutet, dass eine Blende, die durch Laserablation für Ligand oder kryoschützende Abgabe an die Kristalle in die Folie durchbohrt wurde, offen bleibt, was die Wahrscheinlichkeit einer Flüssigkeitsverdunstung erhöht. Dies steht im Gegensatz zu unserem Design, bei dem Kristalle nicht direkt der Umwelt ausgesetzt werden, selbst wenn die COC-Folie mehrmals durchbohrt wird.

Eignung für In-situ-Beugungsexperimente bei Umgebungstemperatur. Der Probenhalter kann geradlinig von der Kristallisationsplatte entfernt, auf eine magnetische Basis geklebt und auf ein Strahlline-Goniometer aufgesetzt werden. Bei einem Beugungsexperiment bei Raumtemperatur ist es ratsam, die Probe in einen Luftstrom mit definierter Luftfeuchtigkeit33zu bringen. Die Mutterlauge um den Kristall herum kann entfernt werden, bevor der Probenhalter auf das Goniometer gelegt wird, um die Hintergrundstreuung zu reduzieren. Ein solches Setup ist stundenlang stabil.

Eignung des verwendeten Materials für Betrieb und Lagerung bei 100 K. Weder das für die Herstellung des Probenhalters verwendete Material noch die Polyimidfolie werden durch abkühlende auf niedrige Temperaturen34beeinträchtigt. Daher stellt die Arbeit mit dem Probenhalter bei niedriger Temperatur (z. B. 100 K) kein ernsthaftes Problem dar.

Eignung für In-situ-Beugungsexperimente bei 100 K. Für die Datenerfassung bei 100 K in einem Stickstoffstrom muss der Probenhalter wie im vorherigen Absatz von der Kristallisationsplatte entfernt, auf eine magnetische Basis geklebt und auf einem Strahlline-Goniometer bei 100 K in einen gasförmigen Stickstoffstrom von 100 K gegeben werden. Falls gewünscht, kann die Probe auch kryogeschützt sein, obwohl es wahrscheinlich ist, dass dies bei nackten Proben in den meisten Fällen nicht notwendig ist31. Für Experimente mit 100 K eignen sich die Probenhalter Typ 2 und 3 besser, da der äußere Kunststoffring entfernt werden kann. Daher sind sie kleiner und sollten daher weniger anfällig für Vereisung sein. Es kann jedoch auch ein Probenhalter des Typs 1 verwendet werden. Angesichts einer nicht zu hohen Luftfeuchtigkeit in der Versuchshütte und einer richtig ausgerichteten Kryo-System-Vereisung des Halters ist das kein wirkliches Problem.

Einschränkungen. Die Geometrie des Probenhalters ermöglicht eine ungehinderte Beugungsdatenerfassung durch das Rotationsverfahren über einen Gesamtdrehbereich von 160°. Dies ist ausreichend, damit für die meisten Kristallsysteme vollständige Beugungsdatensätze abgerufen werden können. In Fällen, in denen dies nicht möglich ist, müssen Daten aus mehr als Kristall zusammengeführt werden. Wenn Kristalle zusammen wachsen, kann es möglich sein, die Größe des einfallenden Röntgenstrahls so einzustellen, dass nur Teile einzelner Kristalle freigelegt werden. In extremen Fällen muss man möglicherweise auf eine Datenerfassungsstrategie zurückgreifen, die dem MeshAndCollect-Ansatz35ähnelt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass den Stichprobeninhabern zwar gewisse Einschränkungen zugesetzt sind, diese jedoch in den meisten Fällen überwunden werden können. Natürlich ist es immer möglich, dass Situationen auftreten, in denen nichts davon möglich ist. In solchen Fällen kann es sein, dass man auf andere Kristallmontagemethoden zurückgreifen muss.

Wir haben einen neuartigen Probenhaltertyp für die makromolekulare Kristallographie beschrieben und die Eignung der Probenhalter für verschiedene Anwendungen nachgewiesen. Unter Berücksichtigung des einfachen und reproduzierbaren Umgangs mit Proteinkristallen sowie der einzigartigen Eigenschaften der Probenhalter glauben wir, dass sich diese Probenhalter als wertvolle Ergänzung zum Arsenal der Probenhalter für makromolekulare Kristallographie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken BESSY II, betrieben vom Helmholtz-Zentrum Berlin für den Zugang und Support für die Strahlzeit, und den Abteilungen Probenumgebung und Technisches Design für ihre Hilfe bei Der planung und konstruktion und den Zugang zu den 3D-Druckeranlagen.

Materials

AF Satetiss RS Components 101-5738 lint-free paper, multiple retailer
Cannula Dispomed Neoject 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 multiple retailer
COC foil HJ-Bioanalytik GmbH 900360
ComboPlate Greiner Bio-one / Jena Bioscience 662050 / CPL-131 pre-greased plate, multiple retailer
Cryo Vials Jena Bioscience CV-100
Eppendorf Research Plus  Eppendorf 3123000012 0.1 – 2.5 µL volume
Eppendorf Tubes Eppendorf 30125150 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number
Forceps Usbeck FisherScientific 10750313
GELoader Eppendorf Quality Eppendorf 30001222 extruded  tips (0.2 – 20 µL), manufacturer reference number
Magnetic CryoVials Molecular Dimension MD7-402
Microfuge Thermo ThermoFisher Scientific R21
Paper wicks dental2000 64460 Set of paper wicks, multiple retailer
Rotiprotect Nitril-eco  Carl Roth TC14.1 powder free, multiple retailer
SuperClear Plates Jena Bioscience CPL-132 pre-greased plate
UHU super glue UHU GmbH & Co KG 45545 manufacturer reference number, multiple retailer
VeroBlackPlus Alphacam OBJ-40963 manufacturer reference number
XtalTool  Jena Bioscience X-XT-101 sample holder set
XtalTool HT Jena Bioscience X-XT-103 / X-XT-104 SPINE compatible sample holder set
XtalToolBases Jena Bioscience X-XT-105 Magnetic sample holder bases set
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References

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Feiler, C. G., Wallacher, D., Weiss, M. S. An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering. J. Vis. Exp. (149), e59722, doi:10.3791/59722 (2019).
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