حامل عينة الكل في واحد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع الحد الأدنى من تشتت الخلفية
Summary
يتم تقديم حامل عينة جديد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع بروتوكول التعامل المناسب. يسمح النظام بنمو البلورات، ونقع الكريستال وجمع بيانات الانعراج في الموقع في كل من درجة الحرارة المحيطة والمبردة دون الحاجة إلى أي تلاعب بالكريستال أو التركيب.
Abstract
البلورات الأشعة السينية الجزيئية (MX) هو الأسلوب الأكثر بروزا للحصول على عالية الدقة المعرفة ثلاثية الأبعاد من الجزيئات البيولوجية. ومن الشروط الأساسية لهذه الطريقة أن العينة البلورية ذات الترتيب العالي تحتاج إلى أن تزرع من الجزيئات الكبيرة التي يتعين دراستها، والتي تحتاج بعد ذلك إلى الاستعداد لتجربة الانعراج. هذا الإجراء إعداد ينطوي عادة على إزالة البلورة من الحل، الذي كان يزرع، نقع من الكريستال في محلول ليجاند أو محلول الحماية من البرد ومن ثم تجميد الكريستال على جبل مناسبة للتجربة. وهناك مشكلة خطيرة لهذا الإجراء هو أن البلورات الجزيئية الكلية غالبا ما تكون غير مستقرة ميكانيكيا وهشة إلى حد ما. وبالتالي، فإن التعامل مع مثل هذه البلورات الهشة يمكن أن يصبح بسهولة عنق الزجاجة في محاولة تحديد الهيكل. أي قوة ميكانيكية تطبق على مثل هذه البلورات الحساسة قد تخل التعبئة العادية للجزيئات، ويمكن أن يؤدي إلى فقدان قوة الانعراج من البلورات. هنا، نقدم رواية الكل في واحد حامل العينة، والتي تم تطويرها من أجل التقليل من خطوات التعامل مع بلورات وبالتالي لتحقيق أقصى قدر من معدل النجاح من تجربة تحديد هيكل. حامل العينة يدعم إعداد قطرات الكريستال عن طريق استبدال الزلاجات غطاء المجهر المستخدمة عادة. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح التلاعب في مكان الكريستال مثل نقع الليجان، والحماية من البرد وتشكيل معقدة دون أي فتح تجويف تبلور ودون التعامل مع الكريستال. وأخيراً، تم تصميم حامل العينة من أجل تمكين جمع بيانات الانعراج بالأشعة السينية في الموقع في كل من درجة الحرارة المحيطة والمبردة. وباستخدام حامل العينة هذا، فإن فرص إتلاف البلورة في طريقها من التبلور إلى جمع بيانات الانعراج تتقلص إلى حد كبير نظراً لأن التعامل المباشر مع الكريستال لم يعد مطلوباً.
Introduction
وتشكل معرفة البنية الثلاثية الأبعاد للجزيئات الجزيئات البيولوجية حجر الزاوية الهام في جميع البحوث البيولوجية والبيوكيميائية والطبية الحيوية الأساسية. وهذا يمتد حتى إلى جوانب ترجمة معينة من هذه البحوث، مثل اكتشاف المخدرات على سبيل المثال. من بين جميع الطرق للحصول على هذه المعلومات ثلاثية الأبعاد في البلورات الأشعة السينية القرار الذري هو أقوى وأبرز واحد كما يتضح من حقيقة أن 90٪ من جميع المعلومات الهيكلية المتاحة يتم المساهمة من خلال الأشعة السينية علم البلورات1. والشرط الأساسي الرئيسي لبلورة الأشعة السينية، وهو في الوقت نفسه قيدها الرئيسي، هو أنه يتعين إنتاج بلورات ذات نوعية الانعراج وإعدادها لتجربة الانعراج. ولا تزال هذه الخطوة تشكل أحد الاختناقات الرئيسية في الأسلوب.
تاريخيا، تم جمع بيانات الانعراج من بلورات البروتين في درجة الحرارة المحيطة. تم نقل بلورات الفردية بعناية في الشعيرات الدموية الزجاج أو الكوارتز قبل جمع البيانات، وأضيفت الأم الخمور إلى الشعيرات الدموية بحيث بلورات لن تجف ومختومة الشعيرات الدموية2،3، 4. ومنذ الثمانينات، أصبح من الواضح أكثر وأكثر أنه نظرا للخصائص المؤينة للإشعاع X والحساسية الإشعاعية الوشيكة للبلورات الجزيئية الكلية، فإن جمع البيانات في درجة الحرارة المحيطة يشكل قيودا شديدة على الطريقة. وبالتالي، تم تطوير نهج للتخفيف من آثار الأضرار الناجمة عن الإشعاع عن طريق تبريد البلورات الجزيئية الكلية إلى 100 K وجمع بيانات الانعراج في مثل هذه درجة الحرارة المنخفضة5و6. للعمل في درجات حرارة منخفضة، أصبح تركيب العينات في الشعيرات الدموية غير عملي بسبب انخفاض معدل نقل الحرارة. على الرغم من هذا، هناك جهود مستمرة لاستخدام الشعيرات الدموية أيضا، ولا سيما من التجارب التبلور مكافحة الانتشار، للعمل الانكسار منخفضة درجة الحرارة7،8، ولكن ، بغض النظر عن ذلك ، أصبح المعيار نهج في علم البلورات الجزيئية لجبل بلورات الجزيئات الكلية التي عقدت من قبل فيلم رقيقة من الخمور الأم داخل حلقة رقيقة السلكية9,10. على الرغم من أن عددا من التحسينات (على سبيل المثال، إدخال الحلقات الحجرية والهياكل المماثلة11)قد أدخلت مع مرور الوقت لهذا تصاعد حلقة على أساس، المبادئ الأساسية التي وضعت في أوائل التسعينات لا تزال قيد الاستخدام حتى اليوم. ويمكن القول بأمان أن معظم مجموعات بيانات الانعراج على بلورات الجزيئات الكلية في الوقت الحاضر لا تزال تعتمد على هذا النهج5.
وبمرور الوقت، كانت هناك بعض التطورات والتعديلات الجديدة المثيرة للاهتمام في طريقة التركيب القائمة على الحلقة، ولكن هذه النهج لم تعتمد حتى الآن على نطاق واسع في المجتمع. واحد هو ما يسمى حلقة أقل تصاعد من البلورات، والتي وضعت لتحقيق انخفاض الخلفية تشتت12،13،14. آخر واحد هو استخدام أغلفة الجرافين لالتفاف العينات البلورية وحمايتها من الجفاف. الجرافين هو مادة مناسبة جيدا في هذا الصدد بسبب انخفاض جدا الأشعة السينية تشتت الخلفية15.
في الآونة الأخيرة، ركزت التطورات في مجال يتصاعد عينة أساسا على توحيد يتصاعد بهدف زيادة الإنتاجية عينة16 أو على تصميم يتصاعد، والتي يمكن أن تعقد أكثر من عينةواحدة 17،مثل على سبيل المثال الأغشية المنقوشة على إطار السيليكون، والتي هي قادرة على عقد مئات من بلورات صغيرة في الغالب في مجال البلورات المسلسل18،19،20،21،22.
جميع وسائل تركيب العينة التي نوقشت حتى الآن لا تزال تتطلب درجة ما من التدخل اليدوي، مما يعني أن هناك خطرا متأصلا من التسبب في أضرار ميكانيكية للعينة. ولذلك، يجري البحث عن نُهج جديدة عن طريق هندسة بيئة العينة بحيث يمكن جمع بيانات الانعراج عن البلورات داخل بيئة نموها. ويسمى أحد هذه الطرق في الموقع أو لوحة الفرز23،24 ويتم تنفيذه بالفعل في عدد من البلورات الجزيئية في مختلف المصادر سينكروترون في جميع أنحاء العالم25. ومع ذلك، فإن استخدام هذه الطريقة محدود بالمعلمات الهندسية للوحة الكريستال والمساحة المتاحة حول نقطة العينة من الصك.
بعد نهج آخر يتحقق في ما يسمى نظام كريستال دايركت26. هنا، يتم حصاد قطرات التبلور بالكامل تلقائيا. رقائق التي تم زرع البلورات هي مخصصة قطع باستخدام الليزر وتستخدم مباشرة كما حامل العينة27.
في العمل الموصوف هنا، كان الهدف هو تطوير حامل العينة، والتي من شأنها أن تسمح للمستخدم لنقل العينة البلورية من غرفة نموها إلى جهاز جمع البيانات دون لمسها والتي من شأنها أن تمكن المستخدم من التعامل مع العينة بسهولة. منذ العديد من الباحثين في مجال علم البلورات الجزيئية لا تزال تستخدم شكل تبلور 24 جيدا لتحسين نمو الكريستال عن طريق تعديل الظروف المحددة في حملات الفحص الكبيرة، تم تصميم حامل العينة الجديدة لتكون متوافق مع هذا التنسيق. وفي ما يلي، سيُوصف تصميم حامل العينة الجديد، كما سيبين عن طريقة التعامل مع حامل العينة وأدائه لجمع البيانات في الموقع ونقع الليجان. وأخيراً، سيتم مناقشة مدى ملاءمة حامل العينة الجديد هذا، فضلاً عن القيود التي يفرضها على مختلف خطوات العمل.
Protocol
Representative Results
Discussion
ملاءمة لتجارب التبلور. ويمكن استخدام حاملي العينات الجديدة لتجارب تبلور الإسقاط المعلقة القياسية باستخدام لوحات من نوع Linbro ذات 24 بئراً (النوعان 1 و2)، أو لوحات البصمة SBS ذات الـ 24 بئراً التي يبلغ قطر كل بئر فيها 18 مم (النوع 3). ويمكن استخدامها بدلا من المجهر القياسية تغطية زلات. احباط COC غير متبلور يضمن التهوية من النظام. رصد تجربة تبلور ممكن باستخدام المجهر الضوئي انتقال، وذلك بسبب استخدام رقائق عالية الوضوح. على حد علمنا، لا يوجد أصحاب عينات أخرى للوحات تبلور 24 جيدا، والتي من شأنها أن تسمح التلاعب الكريستال أو التجارب الانعراج، دون إزالة ميكانيكيا الكريستال من قطرة، التي تزرع. هذا هو من أهمية خاصة، لأن العديد من الباحثين في هذا المجال لا تزال تعتمد على لوحات مثل التحسين الكريستال، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن كميات أكبر قطرة يمكن استخدامها بالمقارنة مع 96 جيدا لوحات الجلوس قطرة. مع هذه الكميات قطرة أكبر، يمكن الحصول على بلورات أكبر.
ملاءمة للتلاعبالكريستال. نظرا لخصائص الشفاء الذاتي من احباط COC الخارجي وهيكل ميكرومبوريس من احباط بوليميد الأصفر الداخلي، يمكن الوصول إلى بيئة الكريستال والبلورات يمكن التلاعب بها دون نقلها ميكانيكيا إلى حاويات أخرى. وهذا يجعل أصحاب العينة مريحة للغاية. النظام الوحيد الآخر الذي نعرفه، والذي يسمح لهذا الوصول غير المباشر واللطيف إلى الكريستال، هو نظام CrystalDirect26. ومع ذلك، CrystalDirect أقل مرونة منذ لوحات التبلور الخاصة 96 جيدا يجب أن تستخدم. احباط، والتي تنمو البلورات، هو نفسه أن الأختام تجربة تبلور وأنها ليست الشفاء الذاتي. وهذا يعني أن الفتحة التي تم اختراقها في احباط عن طريق الاستئصال بالليزر لligand أو تسليم المبردة للحماية إلى بلورات ستبقى مفتوحة، مما يزيد من فرصة لتبخر السائل. هذا هو على النقيض من تصميمنا، حيث بلورات لن تتعرض مباشرة للبيئة حتى لو يحصل مثقوب احباط COC عدة مرات.
ملاءمة تجارب الانعراج في الموقع عند درجة الحرارة المحيطة. يمكن إزالة حامل العينة من لوحة التبلور بطريقة مستقيمة إلى الأمام، عالقة على قاعدة مغناطيسية ووضعها على مقياس الشعاع. لتجربة الانعراج في درجة حرارة الغرفة، فمن المستحسن وضع العينة في تيار الهواء من الرطوبة المحددة33. ويمكن إزالة الخمور الأم حول الكريستال قبل وضع حامل العينة على مقياس الغونية من أجل الحد من تشتت الخلفية. هذا الإعداد مستقر لساعات.
ملاءمة المواد المستخدمة للتشغيل والتخزين في 100ك. لا المواد المستخدمة لإنتاج حامل العينة ولا فيلم polyimide تتأثر سلبا عن طريق تبريد هالهم وصولا الى درجات حرارة منخفضة34. ومن ثم، فإن العمل مع حامل العينة في درجة حرارة منخفضة (على سبيل المثال، 100 ك) لا يشكل مشكلة خطيرة.
ملاءمة تجارب الانعراج في الموقع في 100 ك. لجمع البيانات في 100 K في تيار النيتروجين، حامل العينة يحتاج إلى إزالتها من لوحة تبلور كما هو الحال في الفقرة السابقة، عالقة على قاعدة مغناطيسية ووضعها في تيار النيتروجين الغازية في 100 K على مقياس غونيميتر شعاعي. إذا رغبت في ذلك، يمكن أيضا أن تكون محمية بالتبريد العينة، على الرغم من أنه من المرجح أن عينات عارية هذا قد لا يكون ضروريا في معظم الحالات31. وبالنسبة للتجارب التي تجري عند 100 ألف، فإن حاملي العينات من النوعين 2 و3 أكثر ملاءمة لأن الحلقة البلاستيكية الخارجية يمكن إزالتها. وبالتالي، فهي أصغر حجما، وبالتالي ينبغي أن تكون أقل عرضة للجليد. ومع ذلك، يمكن استخدام حتى حامل عينة من النوع 1. نظرا للرطوبة ليست عالية جدا في القفص التجريبية ومحاذاة بشكل صحيح نظام التبريد الجليد حتى من حامل ليست حقا مشكلة.
القيود. تسمح هندسة حامل العينة بجمع بيانات الانعراج دون عائق من خلال طريقة التناوب على نطاق دوران إجمالي يبلغ 160 درجة. وهذا يكفي بحيث يمكن الحصول على مجموعات بيانات الانعراج المكتمللمعظم الأنظمة البلورية. في الحالات التي لا يكون ذلك ممكناً، يجب دمج البيانات من أكثر من الكريستال معاً. عندما تزرع بلورات معا، قد يكون من الممكن لضبط حجم شعاع الأشعة السينية الحادث بحيث يتم الكشف عن أجزاء فقط من بلورات الفردية. وفي الحالات القصوى، قد يحتاج المرء إلى اللجوء إلى استراتيجية لجمع البيانات مماثلة لنهج MeshAndCollect35. وباختصار، في حين أن هناك بعض القيود المرتبطة بحاملي العينات، يمكن التغلب عليها في معظم الحالات. وبطبيعة الحال، فمن الممكن دائما أن تواجه حالات، والتي لا شيء من هذا ممكن. في مثل هذه الحالات، قد يحتاج المرء إلى اللجوء إلى طرق أخرى تصاعد الكريستال.
لقد وصفنا نوع جديد من حامل العينة للبلورات الجزيئية الكلية وأظهرنا مدى ملاءمة حاملي العينات لمختلف التطبيقات. مع الأخذ بعين الاعتبار التعامل مع بلورات البروتين بسيطة وقابلة للتكرار، فضلا عن الخصائص الفريدة لأصحاب العينة، ونحن نعتقد أن هذه العينات أصحاب سوف يثبت أن تكون إضافة قيمة إلى ترسانة من أصحاب العينة لmacromolecular البلورات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا BESSY II، التي تديرها هيلمولتز-زينتروم برلين على الوصول إلى وقت الشعاع والدعم، وإدارات بيئة العينة والتصميم التقني لمساعدتها في التصميم والبناء والوصول إلى مرافق الطابعة ثلاثية الأبعاد.
Materials
| AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
| Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
| COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
| ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
| Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
| Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 – 2.5 µL volume |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
| Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
| GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 – 20 µL), manufacturer reference number |
| Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
| Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
| Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
| Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
| SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
| UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
| VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
| XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
| XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
| XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |
References
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Mac Sweeney, A., D’Arcy, A. A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature. Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).
- Kalinin, Y., et al. A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography. Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).
- Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).
- Pflugrath, J. W. Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures. Methods. 34 (3), 415-423 (2004).
- Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
- Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).
- Martínez-Rodríguez, S., et al. Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).
- Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
- Teng, T. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
- Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O’Neill, K., Gillilan, R. Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).
- Jian-Xun, Q., Fan, J. An improved loopless mounting method for cryocrystallography. Chinese Physics B. 19 (1), 010601 (2010).
- Kitatani, T., et al. New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material. Applied Physics Express. 1 (3), 037002 (2008).
- Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).
- Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter. Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).
- Parkin, S., Hope, H. Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals. Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).
- Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5, 10451 (2015).
- Roedig, P., et al. Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).
- Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).
- Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
- Feld, G. K., et al. Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).
- Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).
- Aller, P., et al. Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).
- Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).
- Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
- Antimonov, M., et al. Large-area Kapton x-ray windows. Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F (2015).
- McPherson, A. Penetration of dyes into protein crystals. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).
- Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. Raoult’s law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).
- Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary?. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
- Yano, O., Yamaoka, H. Cryogenic properties of polymers. Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).
