RRNA 2'-O-Metilasyonun DNAzyme bağımlı analizi

1. Suşlar, Medya ve Tampon Tarifleri Burada ayrıntılı olarak maya(S. cerevisiae)medya hazırlayın: YP (%1 w / v maya ekstresi, 2% w / v bakteriyolojik peptone), ve glikoz ve galaktoz stokları 20% w / v. Burada ayrıntılı olarak sodyum asetat (NaAc)-EDTA (AE) tampon hazırlayın: 50 mM NaAc pH 5.3 ve 10 mM EDTA. Burada ayrıntılı olarak 10-23 DNAzyme 4x Kuluçka Tampon hazırlayın: 24 mM Tris pH 8.0, 60 mM NaCl ve 10-23 DNAzyme 4x Reaksiyon Tampon: 200 mM Tris pH 8.0 ve 600 mM NaCl. Burada ayrıntılı olarak 8-17 DNAzyme 2x Reaksiyon Tampon hazırlayın: 200 mM KCl, 800 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7.0, 15 mM MgCl2, ve 15 mM MnCl2. Burada ayrıntılı olarak 10x MOPS Tampon hazırlayın: 200 mM MOPS, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA; pH 7.0 ve 1.5x Örnek Denaturing Tampon: v/v formamid, v/v formaldehit, 1.5x MOPS tamponu. Elde S. cerevisiae suşları, BY4741 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1::SNR13 (BY4741 ama GAL1::SNR13:KANmXolarak); GAL1::SNR47 (BY4741 ama GAL1::SNR47:HIS3mXolarak). Başka herhangi bir maya suşu bu analiz için kullanılabilir. 2. DNAzyme Tasarım Uygun bir veritabanı kullanarak RNA ilgi veya putatif metilasyon sitesi sırasını bulun. S. cerevisiae snoRNA hedefleri için maya snoRNA veritabanını kullanın:http://people.biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php 14 SnR13’e bağımlı site gibi metilasyon alanını bulmak için “snR13” seçeneğini belirleyin ve değiştirilmiş nükleotitin konumunu not edin (örn. snR13 güdümlü A2281 in 25S rRNA). Uygun veritabanını kullanarak değiştirilmiş nükleotitin yukarı ve aşağı akış dizilerini bulun. S. cerevisiae için Saccharomyces Genom Veritabanını kullanın: https://www.yeastgenome.org/ RdN25 (25S rRNA kodlama) gibi hedef gen adını arayın. “Sıra” sekmesinden, 10-23 DNAzyme titrezi ve 20 nükleotit upstream (5′ kol) ve 8-17 DNAzyme için metilasyon alanının aşağı (3’kol) kullanırken metilasyon alanının yukarı (5′ kol) yukarı (5′ kol) ve aşağı (3’kol) metilasyon alanının yukarı (5′ kol) ve aşağı (3 ‘kol) seçin. 5′ ve 3′ koldan oluşan tamamlayıcı diziler oluşturun. Böğür 10-23 veya 8-17 DNAzyme katalitik dizili 5′ ve 3’ kolların tamamlayıcı dizileri. Tedarikçiden normal bir DNA oligonükleotid olarak Sipariş DNAzyme. 3. S. cerevisiae Büyüme Koşulları NOT: S. cerevisiae BY4741 suş türevleri kullanıldı, hangi ya SNR13 veya SNR47 snoRNA ekspresyonu indükleyici GAL1 organizatörü tahrik edilir. Sentezlerini indüklemek veya inhibe etmek için, galaktoz(GAL1-bağımlıtranskripsiyon) veya glikoz(GAL1bağımlı transkripsiyon kapalı) içeren orta hücreler büyür. Bir kontrol olarak, galaktoz veya glikoz üzerinde yetiştirilen yabani türü (BY4741) kullanın. Uygun bir ortamda ve koşullarda maya suşları büyümek. GAL1::SNR13 ve GAL1::SNR47 suşlarının yanı sıra İzojenik yabani tip suşları analiz etmek için, yp medianın 50 mL’sinde %2 glikoz (YPD) veya orta üstel faza 30 °C’de galaktoz (YPGal) ile hücre yetiştirin. Santrifüj hücreleri 1.000 x g, 4 °C’de 3 dk. Supernatant atın ve pelet tutun. Hücre peletlerini sıvı nitrojen de dondurun ve -80 °C’de saklayın.DİkKAT: Sıvı nitrojen ciddi kriyojenik yanıklara neden olabilir. Her zaman koruyucu giysiler giyin ve güvenlik önlemleri alın.NOT: Hücre peletleri -80 °C’de 1 aya kadar saklanabilir. Protokol gerekirse burada duraklatılabilir. 4. RNA İzolasyon15 NOT: RNA’yı yalıtmak için en uygun yöntemi kullanın. Maya S. cerevisiaeiçin, sıcak-fenol RNA ekstraksiyon kullanılabilir. 1 mL buz gibi su ekleyin, peletleri yeniden askıya alın ve yeniden askıya alınan hücreleri 1,5 mL mikrotüplere aktarın. 4 °C’de 10 s için 20.000 x g’de santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. 400 μL’lik AE arabelleği ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın.NOT: 4.4-4.15 adımları aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında gerçekleştirilir. SDS’nin 40 μL’si ve 400°L asit fenol (pH 4.5) ekleyin.DİkKAT: Fenol toksik tir ve bir duman başlığı altında ele alınmalıdır. Fenol ile çalışırken her zaman laboratuvar önlüğü, koruyucu eldiven ve gözlük takın. Atıkları kurumsal düzenlemelere göre bertaraf edin. 20 s için girdap tarafından iyice karıştırın. 10 dk için 65 °C’de kuluçka. Her 2 dakika, yavaşça açın ve basınç serbest bırakmak için tüp kapatın ve fazları karıştırmak için 2-3 kez tüp çevirmek. Tüpleri -80 °C’ye aktarın ve 10 dakika kuluçkaya yatırın. Oda sıcaklığında 5 dakika için, 20.000 x gbank ve santrifüj tüpler defrost. Üst fazı 400 μL asit fenol içeren yeni bir tüpe aktarın:kloroform:izoamyl alkol (25:24:1). İnterfazı bozmayın.DİkKAT: Kloroform toksiktir ve duman kaputunun altında ele alınmalıdır. Kloroform la çalışırken her zaman laboratuvar önlüğü, koruyucu eldiven ve gözlük takın. Atıkları kurumsal düzenlemelere göre bertaraf edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 20.000 x g 30 s ve santrifüj için girdap tarafından iyice karıştırın. Üst fazı (~400 μL) 400 μL kloroform içeren yeni bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 20.000 x g 30 s ve santrifüj için girdap tarafından iyice karıştırın. Üst fazı (~300-350 μL) 1 mL EtOH ve 40 μL 7,5 M amonyum asetat (NH4AC) içeren yeni bir tüpe aktarın. Tüpü birkaç kez çevirerek karıştırın. -80 °C’de 2 saat veya geceleme -20 °C’de kuluçkaya yatırın.NOT: Yordam burada duraklatılmış olabilir. Santrifüj 20.000 x g, 4 °C’de 10 dk. Küçük, beyaz bir RNA pelet tüpün altında görünür hale gelecektir. Peleti rahatsız etmemek için boru lar oluşturarak EtOH’u çıkarın. Oda sıcaklığında 5 dakika için 20.000 x g EtOH ve santrifüj 1 mL ekleyin. Pipetleme ile EtOH’u çıkarın. 15 s için 20.000 x g santrifüj ve 2-20 μL pipet ile kalan EtOH çıkarın. Tüp 5 dakika boyunca bankta açık bırakın RNA pelet kuru.NOT: RNA peleti kuruduğunda rengini beyazdan saydama değiştirir. RNA peletini 30 μL RNase/DNase içermeyen H2O’da yeniden askıya alın, tüpü hemen buzun üzerine aktarın ve mikrospektrofotometredeki RNA konsantrasyonu ölçün. Örnekleri -20 °C’de dondurun.NOT: RNA -20 °C’de 1 aya kadar ve -80 °C’de 1 yıla kadar saklanabilir. Yordam burada duraklatılmış veya doğrudan bir sonraki adıma devam edilebilir. 5. DNAzyme Sindirim 10-23 DNAzyme sindirim 1,5 mL’lik tüplerde 5 g RNA, 200 pmol 10-23 DNAzyme (2 μL 100 mM stok çözeltisi) ve 2,5 μL 4x 10-23 Kuluçka Tamponu toplam hacminde 10 μL’lik bir kuluçka karışımı hazırlar. Tüpleri 95 °C’de belirlenen kuru bir ısı bloğuna aktarın ve 3 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpleri hemen buzüzerinde aktarın ve 5 dakika kuluçkaya yatırın. Kısa bir süre aşağı dön ve tüpleri buza geri koy. 20 U RNase inhibitörü ekleyin (örn. 0.5 μL RiboLock RNase inhibitörü). Tüpleri 25 °C’ye ayarlanmış kuru bir ısı bloğuna yerleştirin ve 10 dakika kuluçkaya yatırın. Bu arada, 4x 10-23 Reaksiyon Tamponunun 5 μL’sini 300 mM MgCl2 ve 1 μL H2O.’yu 37 °C’ye ayarlanmış kuru bir blokta yerleştirerek 1,5 μL’lik bir tüpte reaksiyon karışımı hazırlayın. Kuluçka karışımını 37 °C’ye ayarlanmış kuru bir ısı bloğuna aktarın ve önceden ısıtılmış reaksiyon karışımından 10°L ekleyin. Reaksiyonu 37 °C’de 1 saat kuluçkaya yatırın. Tüpleri buzüzerinde aktarın ve adım 5.3.1’e geçin. 8-17 DNAzyme sindirim Toplam hacmi 6 μL olan 5 μg RNA içeren 1,5 mL’lik bir mikrotüp hazırlayın. 8-17 DNAzyme 400 pmol (100 mM stok tan 4 μL) ile 1,5 mL mikrotüp hazırlayın. Tüpü buzda tut. Tüpleri 95 °C için ayarlanmış kuru bir ısı bloğuna ve 2 dk kuluçkaya yatırın. RNA örneğini buz üzerinde hareket ettirin. 5 s için DNAzyme ile tüp aşağı spin ve 10 dakika için 25 °C’de kuluçka. Aynı zamanda 10 μL 2x 8-17 Reaksiyon Tamponu ve 25 °C’de kuluçkaya yatan 1,5 mL’lik bir tüp hazırlayın. DNAzyme ile tüpe önceden ısıtılmış 2x Reaksiyon Tamponu 10 μL ekleyerek bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Reaksiyon karışımının 14 μL’sini RNA ile tüpe aktarın ve 20 U RNase inhibitörü ekleyin. Reaksiyonu 2 5 °C’de 2 saat kuluçkaya yatırın. Tüpü buz üzerinde aktarın ve RNA arınma sınamaya geçin (adım 5.3.1). RNA arınma Reaksiyon tüpüne 350 μL su ve 400 μL kloroform ekleyin, 30 s’lik girdap la karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 20.000 x g’de santrifüj de karıştırın. Üst fazı (~300-350 μL) 1 mL EtOH, 40 μL 7,5 M NH4AC ve 1 μL glikojen (10 μg/μL) içeren yeni bir tüpe aktarın. Tüpü birkaç kez çevirerek karıştırın. -80 °C’de 2 saat veya geceleme -20 °C’de kuluçkaya yatırın.NOT: Yordam burada duraklatılmış olabilir. 4,15’ten 4,21’e kadar olan adımları yineleyin. RNA peletini 10 μL RNase/DNase içermeyen H2O’da yeniden askıya alın ve tüpleri hemen buzüzerinde aktarın. Örnekleri -20 °C’de dondurun.NOT: RNA bir aya kadar -20 °C’de ve 1 yıla kadar -80 °C’de saklanabilir. Prosedür burada duraklatılmış veya RNA elektroforez ini devam edebilir. 6. RNA Elektroforez Sprey elektroforez ekipmanları (tank, tepsi, tarak) ile 1% SDS, 15 dakika bekletin ve ddH2O bol durulayın. 127,5 mL ddH2O’da 1,5 g agarose’u mikrodalgada ısıtarak eritin. Agarose çözeltisine 15 mL 10x MOPS ve 7,5 mL formaldehit ekleyin (toplam hacim 150 mL’dir).DİkKAT: Formaldehit toksiktir ve bir duman başlığı altında ele alınmalıdır. Formaldehit ile çalışırken her zaman laboratuvar önlüğü, koruyucu eldiven ve gözlük takın. Atıkları kurumsal düzenlemelere göre bertaraf edin. Agarose çözeltisine uygun miktarda jel lekesi ekleyin (örn. 15 μL SYBR Güvenli DNA jeli lekesi). Iyice karıştırın ve tepsiye agarose dökün. Hemen jel bir tarak yerleştirin. Duman kaputunun altında 45 dakika bekletin. Hafif hassasiyetli jel lekesi kullanırken tepsiyi alüminyum folyo ile kaplayın. 1x MOPS tampon600 mL hazırlayın. RNA numune hazırlama 1,5 mL’lik bir tüpte, sindirilmiş ve saflaştırılmış RNA numunesinin 10 μL’sini, 5 μL’lik Numune Denatüre Tampon’u ve 0,5 μL’lik 6x Yükleme Boyasını birleştirin.DİkKAT: Formamide toksik tir ve duman kaputunun altında ele alınmalıdır. Formamid ile çalışırken her zaman laboratuvar önlüğü, koruyucu eldiven ve gözlük takın. Atıkları kurumsal düzenlemelere göre bertaraf edin. 5 dk. 70 °C’de kuluçkaya yatan RNA örnekleri, numuneleri buz üzerinde aktarın. 5 dakika kuluçka. Jeli yüklemeden önce kısa bir süre aşağı dön. Elektroforez tankına jel koyun ve 1x MOPS tampon ile doldurun. Her numunenin (15°L) tüm hacmini jel üzerine yükleyin. Bromofenol mavisi jel uzunluğunun 2/3’üne ulaşana kadar 80 V’da çalıştırın. Seçilen jel lekesini (örneğin, UV transilluminator) tespit etmek için uygun bir görüntüleyici kullanarak jeli görüntüleyin.