rRNA 2'-O-メチル化のDNAzyme依存性分析

1. 株、メディア、およびバッファレシピ ここで詳しく説明されているように酵母(S.セレビシエ)メディアを調用する:YP(1%w/v酵母エキス、2%w/v細菌性ペプトン)、およびグルコースおよびガラクトースストックは20%w/vである。 ここで詳しく説明されているように酢酸ナトリウム(NaAc)-EDTA(AE)バッファーを調製する:50 mM NaAc pH 5.3および10mM EDTA。 ここで詳しく説明されているように10-23 DNAzyme 4xインキュベーションバッファを準備する:24 mMトリスpH 8.0、60 mM NaClおよび10-23 DNAzyme 4x反応バッファー:200 mMトリスpH 8.0および600 mM NaCl。 ここで詳しく説明されているように8-17 DNAzyme 2x反応バッファーを準備する:200 mM KCl、800 mM NaCl、100 mM HEPES pH 7.0、15 mM MgCl2、および15 mM MnCl2. ここで詳しく説明されているように10x MOPSバッファを準備する:200 mM MOPS、50 mM NaAc、1 mM EDTA;pH 7.0および1.5xサンプル脱電バッファー:50%v/vホルムアミド、20%v/vホルムアルデヒド、1.5x MOPSバッファー。 S. セレビシエ株を得る, BY4741(MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0);GAL1::SNR13(BY4741としてしかしGAL1::SNR13:KANmX)GAL1::SNR47(BY4741として、GAL1::SNR47:HIS3mX)。他の酵母株は、この分析に使用することができます。 2. DNAzymeデザイン 適切なデータベースを使用して、関心のあるRNA配列または推定メチル化部位を見つけます。S.セレビシエ・スノールナ標的の場合、酵母snoRNAデータベースを使用する:http://people.biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php 14 目的のメチル化部位を見つけるには、例えば、snR13依存部位を選択し、「snR13」を選択し、修飾されたヌクレオチドの位置をメモする(例えば、snR13誘導A2281を25S rRNAで)。 適切なデータベースを使用して、改変されたヌクレオチドの上流および下流の配列を検索します。S.セレビシエの場合は、サッカロマイセスゲノムデータベースを使用https://www.yeastgenome.org/ 標的遺伝子名例、RDN25(コード25S rRNA)を検索する。 「シーケンス」タブから、10-23 DNAzymeアッセイを使用する場合は、メチル化部位の上流10-15ヌクレオチド(5’腕)と下流(3’アーム)を選択し、8-17Nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnynnnnnnnnnnnnnnynnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnsの10-23 DNAzymeアッセイ 5’と3’腕の補完的なシーケンスを作成します。 フランク10-23または8-17 DNAzyme触媒配列は、5’および3’腕の相補配列を持つ。 サプライヤーから通常のDNAオリゴヌクレオチドとしてDNAzymeを注文します。 3. S. セレビシエ成長条件 注:S.セレビシエBY4741株誘導体が使用され、SNR13またはSNR47 snoRNAのいずれかの発現が誘導性GAL1プロモーターから駆動される。それらの合成を誘導または阻害するために、ガラクトース(GAL1-依存転写オン)またはグルコース(GAL1-依存転写オフ)を含む培地上で細胞を増殖させる。対照として、ガラクトースまたはブドウ糖のいずれかで成長した野生型株(BY4741)を使用する。 適切な培地および条件で酵母株を成長させる。GAL1::SNR13およびGAL1:SNR47株および同位種野生型株を分析するには、2%グルコース(YPD)またはガラクトース(YPGal)のいずれかでYP培地の50 mLで細胞を成長させ、30°Cから中間指数相に。 遠心分離球は1,000 x gで、4°Cで3分間。 上清を捨て、ペレットを保管してください。 液体窒素中の細胞ペレットを凍結し、-80°Cで保存します。注意:液体窒素は重度の低温熱傷を引き起こすことがある。常に防護服を着用し、安全対策を講じてください。注:細胞ペレットは-80°Cで1ヶ月まで保存することができます。プロトコルは、必要に応じてここで一時停止できます。 4. RNA分離15 注:RNA を分離するには、最も適切な方法を使用します。酵母S.セレビシエの場合、ホットフェノールRNA抽出が使用できます。 1 mLの氷冷水を加え、ペレットを再懸濁し、再懸濁細胞を1.5mLマイクロチューブに移す。 4°Cで10sの20,000 x gで遠心分離機を取り除き、上清を取り除きます。 AE バッファーの 400 μL を追加し、セルを再中断します。注:手順4.4-4.15は、特に明記されていない限り、室温で行われます。 10% SDS の 40 μL と 400 μL の酸性フェノール (pH 4.5) を追加します。注意:フェノールは有毒であり、ヒュームフードの下で処理する必要があります。フェノールを使用する場合は、必ずラボコート、保護手袋、眼鏡を着用してください。制度上の規制に従って廃棄物を処分する。 20sの渦でよく混ぜます。 65°Cで10分間インキュベートします。2分ごとに、穏やかにチューブを開閉して圧力を解放し、フェーズを混合するためにチューブを2〜3回反転させます。 チューブを-80 °Cに移し、10分間インキュベートします。 ベンチの管を解凍し、室温で5分間、20,000 x gで遠心分離機を解凍します。 上相を400μL酸フェノールを含む新しいチューブに移す:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)。フェーズ間を中断しないでください。注意:クロロホルムは有毒であり、ヒュームフードの下で処理する必要があります。クロロホルムを使用する場合は、必ずラボコート、保護手袋、眼鏡を着用してください。制度上の規制に従って廃棄物を処分する。 室温で10分間20,000 x gで30sと遠心分離機の渦でよく混ぜます。 上相(約400μL)を400μLクロロホルムを含む新しいチューブに移します。 室温で5分間20,000 x gで30sと遠心分離機の渦でよく混ぜます。 上相(~300~350 μL)をEtOHの1mLと7.5M酢酸アンモニウム(NH4 AC)の40μLを含む新しいチューブに移します。チューブを数回反転して混ぜます。 -80 °Cで-20°Cで2時間または一晩-20°Cでインキュベートします。注:手順はここで一時停止できます。 20,000 x gで遠心分離機、4 °Cで10分間。小さい、白いRNAペレットは管の底に見えるようになる。 ペレットの邪魔にならないように、ピペットでEtOHを取り外します。 室温で5分間20,000 x gで70%EtOHと遠心分離機の1 mLを追加します。 ピペッティングで70%EtOHを取り外します。 15秒で20,000 x gで遠心分離し、残りのEtOHを2-20 μLピペットで取り除きます。 チューブをベンチで5分間開けて乾燥させて、RNAペレットを乾燥させます。注:RNAペレットは、乾燥時に白から透明に色を変更します。 RNase/DNaseフリーH2Oの30μLでRNAペレットを再ステーペンし、すぐに氷上にチューブを移し、マイクロ分光光度計でRNA濃度を測定します。 サンプルを-20 °Cで凍結します。注:RNAは-20°Cで1ヶ月まで、-80°Cで1年まで保存できます。手順はここで一時停止するか、次の手順に直接進むことができます。 5. DNAzyme 消化 10-23 DNAzyme 消化 1.5 mLチューブでは、5 μgのRNA、10-23 DNAzymeの200 pmol(100mMストック溶液の2μL)、4x 10-23インキュベーションバッファーの2.5 μLを合計体積10μLの水量で組み合わせてインキュベーションミックスを調製します。 チューブを95°Cに設定された乾燥したヒートブロックに移し、3分間インキュベートします。 チューブを氷の上に直ちに移し、5分間インキュベートします。 短時間スピンダウンし、チューブを氷の上に戻します。 RNase阻害剤の20Uを添加する(例えば、0.5 μLリボロックRNase阻害剤)。 チューブを25°Cに設定した乾燥したヒートブロックに入れ、10分間インキュベートします。 その間、4x 10-23反応バッファーの5 μLを300mM MgCl2および1 μL H2Oの4μLと組み合わせて1.5μLチューブ内の反応混合物を調製し、チューブを37°Cに設定した乾燥ブロックに入れます。 インキュベーションミックスを37°Cに設定した乾燥ヒートブロックに移し、予め温めた反応ミックスの10 μLを加えます。 反応を37°Cで1時間インキュベートする。 氷の上にチューブを移し、ステップ5.3.1に進みます。 8-17 DNAzyme 消化 総体積6μLのRNAを5μgで1.5 mLのマイクロチューブを準備します。 8-17 DNAzyme(100 mMストックのうち4μL)の400 pmolで1.5 mLマイクロチューブを準備します。チューブを氷の上に置いてください。 チューブを95°Cに設定した乾燥したヒートブロックに移し、2分間インキュベートします。 RNA サンプルを氷の上に移動します。 チューブをDNAzymeで5sでスピンダウンし、25°Cで10分間インキュベートします。 同時に、2x 8-17反応バッファーの10 μLの1.5 mLチューブを調製し、25°Cでインキュベートします。 DNAzymeを用いてチューブに予め温められた2x反応バッファーの10 μLを加えて反応混合物を調製する。 RNAを使用してチューブに反応ミックスの14μLを転送し、RNase阻害剤の20Uを追加します。 反応を25°Cで2時間インキュベートする。 チューブを氷の上に移し、RNA精製に進みます(ステップ5.3.1)。 RNA精製 反応管に350μLの水と400μLのクロロホルムを加え、室温で5分間20,000 x gで30sと遠心分離機を渦でよく混ぜます。 上相(~300~350 μL)をEtOHの1mL、7.5M NH4ACの40 μL、グリコーゲンの1μL(10 μg/μL)を含む新しいチューブに移します。チューブを数回反転して混ぜます。 -80 °Cで-20°Cで2時間または一晩-20°Cでインキュベートします。注:手順はここで一時停止できます。 4.15 から 4.21 までの手順を繰り返します。 RnaペレットをRNase/DNaseフリーH2Oの10μLで再ステーペンし、すぐに氷の上にチューブを移します。 サンプルを-20 °Cで凍結します。注:RNAは-20°Cで1ヶ月まで、-80°Cで1年まで保存できます。手順はここで一時停止するか、RNA電気泳動に進むことができます。 6. RNA電気泳動 1%SDSで電気泳動装置(タンク、トレイ、櫛)をスプレーし、15分間放置し、ddH2Oをたっぷり使ってすすいで下さい。 電子レンジで加熱してddH2 Oの127.5mLにアガロース1.5gを溶かします。 アガロース溶液に10x MOPSの15 mLと37%ホルムアルデヒドの7.5 mLを加えます(総容積は150mL)。注意:ホルムアルデヒドは有毒であり、ヒュームフードの下で処理する必要があります。ホルムアルデヒドを使用する場合は、必ずラボコート、保護手袋、眼鏡を着用してください。制度上の規制に従って廃棄物を処分する。 アガロース溶液に適量のゲル染色を加えます(例えば、SYBRセーフDNAゲル染色の15μL)。よく混ぜ、アガロースをトレイに注ぎます。 すぐにゲルに櫛を挿入します。 ヒュームフードの下に45分間放置します。敏感なゲル汚れを使用する場合は、アルミホイルでトレイを覆います。 1x MOPS バッファの 600 mL を準備します。 RNAサンプル調製 1.5 mLチューブで、消化および精製されたRNAサンプルの10 μL、サンプル難化バッファーの5μL、6xローディング色素の0.5 μLを組み合わせます。注意:フォルマミドは有毒であり、ヒュームフードの下で処理する必要があります。フォルマミドを使用する場合は、必ずラボコート、保護手袋、眼鏡を着用してください。制度上の規制に従って廃棄物を処分する。 70°CでRNAサンプルを5分間インキュベートし、氷上にサンプルを移します。5分間インキュベートします。 ゲルにロードする前に、短時間スピンダウンします。 ゲルを電気泳動タンクに入れ、1x MOPSバッファーで満たします。各サンプルの全容積(15μL)をゲルにロードします。ブロモフェノールブルーがゲル長の2/3に達するまで80Vで走る。 選択したゲル汚れを検出するのに適したイメージャー(例えば、UVトランジルミネーション)を用いてゲルを画像化する。