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Developmental Biology

Analyse Dépendante de DNAzyme de rRNA 2'-O-Methylation

Published: September 16, 2019
doi:
10.3791/59700
,
1School of Biosciences,University of Birmingham

Summary

Ici nous présentons un protocole pour le clivage DNAzyme-dépendant de l’ARN. Cela permet une analyse rapide et dépendante du site de l’ARN 2′-O-méthylation. Cette approche peut être utilisée pour l’évaluation préliminaire ou majeure de l’activité du snoRNA.

Abstract

Boîte de guide C/D petits ARN nucléolar (snoRNAs) catalysent 2′-O-méthylation de ribosomal et petit ARN nucléaire. Cependant, un grand nombre de snoRNA dans les eucaryotes plus élevés peuvent proscêtrer promiscuité d’autres espèces d’ARN et 2′-O-méthylate cibles multiples. Ici, nous fournissons un guide étape par étape pour l’analyse rapide et non coûteuse de la méthylation 2′-O spécifique au site à l’aide d’une méthode bien établie utilisant de courts oligonucléotides d’ADN appelés DNAzymes. Ces fragments d’ADN contiennent des séquences catalytiques qui cenferment l’ARN à des positions consensuelles spécifiques, ainsi que des bras d’homologie variables orientant Le DNAzyme vers ses cibles d’ARN. L’activité de DNAzyme est inhibée par 2-‘O-méthylation du nucléotide adjacent au site de clivage dans l’ARN. Ainsi, les DNAzymes, limités seulement par le consensus de la séquence clivée, sont des outils parfaits pour l’analyse rapide de l’ARN snoRNA-mediated 2′-O-méthylation. Nous avons analysé snR13- et snR47-guidé 2’-O-méthylation de l’ARN ribosomal 25S dans Saccharomyces cerevisiae pour démontrer la simplicité de la technique et pour fournir un protocole détaillé pour l’analyse DNAzyme-dépendante.

Introduction

Les modifications de l’ARN jouent un rôle important dans la régulation de l’expression génique. RNA 2′-O-méthylation et pseudouridylation, qui sont guidés par la boîte C/D et la boîte H/ACA petits ARN nucléolaires (snoARN) respectivement, protègent l’ARN de la dégradation et stabilisent leurs structures d’ordre supérieur1,2,3 . Des cibles de SnoRNA ont été identifiées principalement dans les ARN ribosomal (rRNA) et les petits ARN nucléaires (snRNAs). Cependant, dans les eucaryotes plus élevés, il y a potentiellement des centaines de snoRNA sans fonctions assignées et certains d’entre eux peuvent reconnaître plusieurs ARN1,4,5,6,7. Par conséquent, les méthodes qui permettent l’identification et l’analyse des modifications guidées par l’ARNrs sont des outils importants pour découvrir les mécanismes régissant les processus cellulaires.

Un site de méthylation putative 2′-O-méthylation de boîte C/D snoRNA-guided peut être identifié bioinformatiquement et confirmé expérimentalement par de nombreuses techniques, y compris le clivage dirigé par RNase H, ou des méthodes spécifiques au site et à l’échelle du génome, qui emploient la transcription inversée dans les nucléotides bas (dNTP) approche de concentration8,9,10,11. Ces techniques sont très sensibles mais aussi laborieuses et coûteuses, par conséquent, peuvent ne pas convenir pour les essais initiaux ou rapides. L’une des méthodes les plus simples et peu coûteuses pour identifier les sites de méthylation 2′-O est le clivage à ARN dépendant de dNAzyme12. Les AdnNAzymes sont des molécules d’ADN courtes, à brin unique et catalytiques actives capables de clivage endonucleolytique de l’ARN à des positions spécifiques. Il s’agit d’une séquence de noyau conservée et catalytiquement active et de bras de liaison de 5′ et 3′ composés de séquences variables conçues pour s’hybrider par Watson-Crick base-appariement à la cible d’ARN (Figure 1). Ainsi, les bras de 5′ et 3′ livrent la séquence catalytique au site spécifique d’ARN. Le clivage Dépendant de l’ADNestin est inhibé par 2′-O-méthylation du nucléotide placé directement en amont du site de clivage12,13. Cela rend les DNAzymes des outils très pratiques pour l’analyse des sites putatifs ou connus d’ARN 2′-O-méthylation.

Deux types de DNAzymes sont utilisés pour les analyses de modifications d’ARN12. La séquence active de 10-23 DNAzyme (Figure 1A) se compose de 15 nucléotides (5’RGGCTAGCTACAACGA3′) qui forment une boucle autour de l’ARN ciblé purine-pyrimidine (RY) dinuccléotide et catalysent le clivage entre ces deux nucléotides. La purine d’ARN (R) n’est pas base-appariée avec le DNAzyme et le 2′-O-méthylation présente sur le DNAzyme inhibe le clivage. Les bras de liaison de 10-23 DNAzymes sont généralement 10-15 nucléotides longs. La deuxième classe DNAzyme, 8-17 DNAzymes (Figure 1B) contiennent 14 nucléotides catalytiques (5’TCCGACGACGA3′). Les nucléotides C2, C3 et G4 s’associent à C9 G10 et G11 formant une courte structure en boucle de tige. 8-17 DNAzymes censer l’ARN en amont de toute guanine qui est imparfaitement jumelé avec la première thymine de la séquence active DNAzyme. Le nucléotide d’ARN en amont de la guanine n’est pas de base-appariement avec DNAzyme et son 2′-O-méthylation altère le clivage. 8-17 DNAzymes nécessitent des bras d’homologie plus longs d’environ 20 nucléotides pour diriger DNAzyme à sa séquence spécifique.

Ici, nous fournissons un protocole étape par étape pour l’analyse de 2′-O-méthylation de l’ARNr dans Saccharomyces cerevisiae en utilisant 10-23 et 8-17 DNAzyme-dépendant s’approche12,13 (Figure 1C). Ce protocole peut être facilement adapté à d’autres organismes et espèces d’ARN et utilisé pour les analyses rapides, préliminaires ou majeures de l’ARN 2′-O-méthylation spécifique au site.

Protocol

1. Strains, Media, et Buffer Recettes Préparer la levure (S. cerevisiae) médias comme détaillé ici: YP (1% w / v extrait de levure, 2% w / v peptone bactériologique), et le glucose et les stocks de galactose à 20% w / v. Préparer le tampon d’acétate de sodium (NaAc)-EDTA (AE) tel que détaillé ici : 50 mM NaAc pH 5,3 et 10 mM EDTA. Préparer 10-23 DNAzyme 4x Incubation Buffer comme détaillé ici: 24 mM Tris pH 8.0, 60 mM NaCl et 10-23 DNAzyme 4x Reaction Buffer: 200 mM Tris pH 8.0 et 600 mM NaCl. Préparer 8-17 DNAzyme 2x Reaction Buffer tel que détaillé ici: 200 mM KCl, 800 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7,0, 15 mM MgCl2, et 15 mM MnCl2. Préparer 10x MOPS Buffer tel que détaillé ici: 200 mM MOPS, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA; pH 7.0 et 1.5x Sample Denaturing Buffer: 50% v/v formamide, 20% v/v formaldehyde, 1.5x MOPS buffer. Obtenir des souches S. cerevisiae, BY4741 (MATa his3-1 leu2-0 met150 ura30); GAL1::SNR13 (comme BY4741 mais GAL1::SNR13:KANmX); GAL1::SNR47 (comme BY4741 mais GAL1::SNR47:HIS3mX). Toute autre souche de levure peut être utilisée pour cette analyse. 2. Conception DNAzyme Trouvez la séquence d’ARN d’intérêt ou le site de méthylation putative à l’aide d’une base de données appropriée. Pour les cibles S. cerevisiae snoRNA, utilisez la base de données snoRNA de levure : http://people.biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14 Pour trouver le site de méthylation d’intérêt, par exemple, snR13-dépendant site, sélectionnez “snR13” et prendre note de la position du nucléotide modifié (par exemple, snR13-guidé A2281 dans 25S rRNA). Trouvez des séquences en amont et en aval du nucléotide modifié à l’aide d’une base de données appropriée. Pour S. cerevisiae, utilisez la base de données du génome de Saccharomyces : https://www.yeastgenome.org/ Rechercher le nom du gène cible, par exemple, RDN25 (codage 25S rRNA). À partir de l’onglet « séquence », sélectionnez 10 à 15 nucléotides en amont (bras 5) et en aval (3 bras) du site de méthylation lors de l’utilisation d’un étoptod 10-23 DNAzyme et de 20 nucléotides en amont (bras 5′ et en aval (3’bras) du site de méthylation pour un 8-17 DNAzyme. Créez des séquences complémentaires de bras de 5′ et 3′. Flank 10-23 ou 8-17 Séquence catalytique DNAzyme avec des séquences complémentaires de 5′ et 3′ bras. Commandez DNAzyme comme oligonucléotide normal d’ADN du fournisseur. 3. Conditions de croissance de S. cerevisiae REMARQUE: S. cerevisiae BY4741 dérivés de la souche ont été utilisés, dans lequel l’expression de SNR13 ou SNR47 snoRNA est tirée du promoteur inductible GAL1. Afin d’induire ou d’inhiber leur synthèse, les cellules de croissance sur le milieu contenant le galactose(gal1-transcription dépendante de) ou le glucose(GAL1-transcription dépendante hors). Comme contrôle, utilisez la souche de type sauvage (BY4741) cultivée soit sur le galactose ou le glucose. Cultivez des souches de levure dans un milieu et des conditions appropriés. Pour analyser gal1::SNR13 et GAL1::SNR47 souches ainsi que la souche isogénique de type sauvage, les cellules de croissance dans 50 ml de milieu x yP avec soit 2% de glucose (YPD) ou galactose (YPGal) à 30 oC à la phase médiane moyenne exponentielle. Cellules centrifugeuses à 1 000 x g,pendant 3 min à 4 oC. Jeter le supernatant et garder les granulés. Congelez les granulés de cellules dans de l’azote liquide et entreposez-les à -80 oC.MISE EN GARDE: L’azote liquide peut causer de graves brûlures cryogéniques. Portez toujours des vêtements de protection et faites preuve de sécurité.REMARQUE: Les granulés cellulaires peuvent être stockés à -80 oC jusqu’à 1 mois. Le protocole peut être mis en pause ici si nécessaire. 4. ISOLATION DE l’ARN15 REMARQUE: Utilisez la méthode la plus appropriée pour isoler l’ARN. Pour la levure S. cerevisiae, extraction d’ARN de phénol à chaud peut être utilisé. Ajouter 1 ml d’eau glacée, resuspendre les granulés et transférer les cellules en suspension dans des microtubes de 1,5 ml. Centrifugeuse à 20 000 x g pour 10 s à 4 oC et retirer le supernatant. Ajouter 400 l de tampon AE et resuspendre les cellules.REMARQUE: Les étapes 4.4-4.15 sont exécutées à température ambiante sauf indication contraire. Ajouter 40 l de 10 % de SDS et 400 l de phénol acide (pH 4,5).MISE EN GARDE: Le phénol est toxique et doit être manipulé sous une hotte de fumée. Portez toujours une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes lorsque vous travaillez avec du phénol. Éliminer les déchets conformément à la réglementation institutionnelle. Bien mélanger en vortexant pendant 20 s. Incuber à 65 oC pendant 10 min. Toutes les 2 minutes, ouvrez doucement et fermez le tube pour relâcher la pression et retournez le tube 2-3 fois pour mélanger les phases. Transférer les tubes à -80 oC et couver pendant 10 min. Décongeler les tubes sur le banc et la centrifugeuse à 20 000 x g,pendant 5 min à température ambiante. Transférer la phase supérieure dans un nouveau tube contenant 400 l de phénol acide:chloroform:isoamyl alcool (25:24:1). Ne perturbez pas l’interphase.MISE EN GARDE: Le chloroforme est toxique et doit être manipulé sous une hotte de fumée. Portez toujours une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes lorsque vous travaillez avec du chloroforme. Éliminer les déchets conformément à la réglementation institutionnelle. Bien mélanger en vortexant pendant 30 s et centrifugeuse à 20 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Transférer la phase supérieure (400 l) dans un nouveau tube contenant 400 l de chloroforme. Bien mélanger en vortexant pendant 30 s et centrifugeuse à 20 000 x g pendant 5 min à température ambiante. Transférer la phase supérieure (300-350 l) dans un nouveau tube contenant 1 ml d’EtOH et 40 oL d’acétate d’ammonium de 7,5 M (NH4AC). Mélanger en retournant le tube à quelques reprises. Incuber à -80 oC pendant 2 h ou toute la nuit à -20 oC.REMARQUE: La procédure peut être interrompue ici. Centrifugeuse à 20 000 x g, pendant 10 min à 4 oC. Une petite pastille d’ARN blanche deviendra visible au fond du tube. Retirez EtOH par pipetting pour éviter de déranger la pastille. Ajouter 1 ml d’EtOH à 70 % et centrifugeuse à 20 000 x g pendant 5 min à température ambiante. Retirez 70% EtOH par pipetting. Centrifugeuse à 20 000 x g pour 15 s et retirez le reste de l’EtOH avec une pipette de 2 à 20 l. Laisser le tube ouvert sur le banc pendant 5 minutes pour sécher le granule d’ARN.REMARQUE: Le granule d’ARN change sa couleur du blanc au transparent une fois sec. Resuspendre le granule d’ARN dans 30 OL de H2O sans RNase/DNase, transférer le tube immédiatement sur la glace et mesurer la concentration d’ARN sur microspectrophotomètre. Congeler les échantillons à -20 oC.REMARQUE: L’ARN peut être stocké à -20 oC jusqu’à 1 mois et à -80 oC jusqu’à 1 an. La procédure peut être interrompue ici ou procéder directement à l’étape suivante. 5. Digestion DNAzyme 10-23 Digestion DNAzyme Dans des tubes de 1,5 ml, préparez un mélange d’incubation en combinant 5 g d’ARN, 200 pmol de 10 à 23 DNAzymes (2 l de 100 ml de solution de stock) et 2,5 l de tampon d’incubation 4x 10-23 dans un volume total de 10 oL. Gardez les tubes sur la glace. Transférer les tubes dans un bloc de chaleur sèche réglé à 95 oC et couver pendant 3 min. Transférer les tubes immédiatement sur la glace et couver pendant 5 min. Faites tourner brièvement et remettez les tubes sur la glace. Ajouter 20 U of RNase inhibitor (p. ex., 0,5 ‘L RiboLock RNase inhibitor). Placer les tubes dans un bloc de chaleur sèche réglé à 25 oC et couver pendant 10 min. Pendant ce temps, préparer un mélange de réaction dans un tube de 1,5 l en combinant 5 l de 4x 10-23 Reaction Buffer avec 4 ‘L de 300 mM MgCl2 et 1 O H2.Placez le tube dans un bloc sec réglé à 37 oC. Transférer le mélange d’incubation dans un bloc de chaleur sèche réglé à 37 oC et ajouter 10 l de mélange de réaction préréchauffé. Incuber la réaction à 37 oC pendant 1 h. Transférer les tubes sur la glace et passer à l’étape 5.3.1. 8-17 Digestion DNAzyme Préparer un microtube de 1,5 ml avec 5 g d’ARN dans un volume total de 6 L. Maintenir le tube sur la glace. Préparer un microtube de 1,5 ml avec 400 pmol de 8-17 DNAzyme (4 L sur 100 mM de stock). Gardez le tube sur la glace. Transférer les tubes dans un bloc de chaleur sèche réglé à 95 oC et couver pendant 2 min. Déplacer l’échantillon d’ARN sur la glace. Faites tourner le tube avec DNAzyme pendant 5 s et incubez à 25 oC pendant 10 min. Dans le même temps, préparer un tube de 1,5 ml avec 10 l de 2x 8-17 Reaction Buffer et incuber à 25 oC. Préparer un mélange de réaction en ajoutant 10 l de tampon de réaction 2x préréchauffé au tube avec DNAzyme. Transférer 14 L du mélange de réaction au tube avec de l’ARN et ajouter 20 U d’inhibiteur de rNase. Incuber la réaction à 25 oC pendant 2 h. Transférer le tube sur la glace et procéder à la purification de l’ARN (étape 5.3.1). Purification de l’ARN Ajouter 350 l d’eau et 400 l de chloroforme au tube de réaction, bien mélanger en vortexant pendant 30 s et centrifugeuse à 20 000 x g pendant 5 min à température ambiante. Transférer la phase supérieure (300-350 l) dans un nouveau tube contenant 1 ml d’EtOH, 40 oL de 7,5 M NH4AC et 1 l de glycogène (10 g/L). Mélanger en retournant le tube à quelques reprises. Incuber à -80 oC pendant 2 h ou toute la nuit à -20 oC.REMARQUE: La procédure peut être interrompue ici. Répétez les étapes de 4.15 à 4.21. Resuspendre le granule d’ARN dans 10 oL de H2O sans RNase/DNase et transférer les tubes immédiatement sur la glace. Congeler les échantillons à -20 oC.REMARQUE: L’ARN peut être stocké à -20 oC jusqu’à un mois et à -80 oC jusqu’à 1 an. La procédure peut être interrompue ici ou procéder à l’électrophoresis d’ARN. 6. Électrophorésis d’ARN Vaporiser l’équipement d’électrophorèse (réservoir, plateau, peigne) avec 1% SDS, laisser pendant 15 min et rincer avec beaucoup de ddH2O. Dissoudre 1,5 g d’agarose dans 127,5 ml de ddH2O en le chauffant au micro-ondes. Ajouter 15 ml de MOPS 10x et 7,5 ml de formaldéhyde à 37 % à la solution d’agarose (volume total est de 150 ml).MISE EN GARDE: Le formaldéhyde est toxique et doit être manipulé sous une hotte de fumée. Portez toujours une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes lorsque vous travaillez avec du formaldéhyde. Éliminer les déchets conformément à la réglementation institutionnelle. Ajoutez une quantité appropriée d’une tache de gel de choix à la solution d’agarose (p. ex., 15 l de tache de gel d’ADN SYBR Safe). Bien mélanger et verser l’agarose sur le plateau. Insérez immédiatement un peigne dans le gel. Laissez-le 45 min sous le capot de fumée. Couvrir le plateau de papier d’aluminium lorsque vous utilisez une tache de gel sensible à la lumière. Préparer 600 ml de tampon MOPS 1x. Préparation de l’échantillon d’ARN Dans un tube de 1,5 ml, combiner 10 l l de l’échantillon d’ARN digéré et purifié, 5 l de tampon dénaturant d’échantillon et 0,5 l de teinture de chargement 6x.MISE EN GARDE: Le formamide est toxique et doit être manipulé sous une hotte de fumée. Portez toujours une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes lorsque vous travaillez avec du formamide. Éliminer les déchets conformément à la réglementation institutionnelle. Incuber les échantillons d’ARN à 70 oC pendant 5 min. Transférer les échantillons sur la glace. Incuber 5 min. Faites tourner brièvement avant de charger sur le gel. Mettre le gel dans le réservoir d’électrophorèse et remplir avec 1x tampon MOPS. Chargez tout le volume de chaque échantillon (15 l) sur le gel. Courir à 80 V jusqu’à ce que le bleu bromophenol atteigne les 2/3 de la longueur du gel. Imagez le gel à l’aide d’un imageur approprié pour détecter la tache de gel choisie (p. ex., transilluminator UV).

Representative Results

L’utilité du clivage DNAzyme-dépendant dans l’analyse des modifications de rRNA a été montrée récemment dans le contexte de la maturation de snoRNAs13. L’assay DNAzyme-dépendant a été employé pour montrer que le manque de traitement pré-snoRNA de 5′-end affecte des niveaux de 2′-O-méthylation de 25S et 18S rRNA dans S. cerevisiae13. Ici, nous avons utilisé un système de transcription snoRNA inductible pour démontrer l’efficacité et la simplicité de la technique. La boîte C/D snR13 guide la méthylation à deux positions dans 25S rRNA, y compris adenine 2281 (figure 2A). Ce nucléotide est suivi par l’uracil, qui constitue le consensus dinucleotide (RY) cleavable par un 10-23 DNAzyme. La boîte C/D snR47 guide également la méthylation de deux nucléotides dans 25S rRNA (Figure 2B). L’adénine en position 2220 est suivie d’un résidu de guanine et ce dinuccléotide peut être clivé par un 8-17 DNAzyme. Afin d’induire ou d’inhiber la synthèse de snR13 ou snR47 snoRNA, nous avons inséré le promoteur INductible GAL1 en amont des gènes SNR13 ou SNR47 et des cellules cultivées dans le milieu contenant galactose(GAL1-dépendant transcription sur) ou glucose (GAL1-transcription dépendante). Ensuite, l’ARN isolé des cellules GAL1::SNR13 ont été incubés avec 10-23 DNAzyme conçu pour couper 25S rRNA au site snR13-dépendant, entre les nucléotides 2281 et 2282 (Figure 2C). L’ARN de la souche GAL1::SNR47 a été traitée avec 8-17 DNAzyme ciblant le site dépendant du snR47 entre les nucléotides 2220 et 2221 (figure 2D). Comme un contrôle, l’ARN de la souche sauvage-type BY4741 de plus en plus sur le galactose ou le glucose a été incubé avec les deux DNAzymes. L’électrophorèse de l’ARN DNAzyme-traité a indiqué que le rRNA 25S extrait de GAL1::SNR13 et GAL1::SNR47 souches de plus en plus sur galactose (GAL) est resté intact (Figure 3A,B; voies 3). En revanche, l’ARN isolé de GAL1::SNR13 et GAL1:SNR47 cellules de plus en plus sur le glucose (GLC) a été digéré par les DNAzymes respectifs (Figure 3A,B;voies 4). Dans les deux cas, la bande de rRNA 25S a diminué et des produits de clivage de coupure de 5′ et 3′ (A et B) ont été observés. Ceci indique que dans GAL1::SNR13 et GAL1:SNR47 souches, 25S rRNA a été 2′-O-méthylé aux sites snR13- ou snR47-guidé slorsque galactose a été utilisé comme source de carbone et ces snoRNA ont été exprimés. L’absence de méthylation de rRNA 25S quand l’expression de snR13 ou de snR47 a été coupée sur le glucose a permis pour le clivage DNAzyme-dépendant. Aucune digestion d’ARN n’a été observée pour les échantillons de type sauvage(figure 3A,B; voies 1 et 2), car l’expression de snR13 et snR47 est galactose/glucose-indépendant dans cette souche. Par conséquent, rRNA était normalement méthylé et si résistant à l’activité de DNAzymes. Dans l’ensemble, notre expérience montre que l’activité de clivage de 10-23 (figure 3A) et 8-17 (Figure 3B) DNAzymes corrélée avec l’absence de la boîte C/ D snR13 ou snR47, indiquant clairement que ces snoRNA sont responsables de 25S rRNA 2′-O-méthylation à des sites particuliers. Figure 1 : Les DNAzymes et leurs substrats d’ARN. (A) 10-23 DNAzymes cleave a purine-pyrimidine (RY) RNA dinucleotide. R dans l’ARN n’est pas jumelé avec DNAzyme, tandis que Y est complémentaire à la base R dans le DNAzyme. La méthylation de la purine (R) dans l’ARN supprime le clivage DNAzyme-dépendant. (B) 8-17 DNAzymes censer l’ARN en amont de la guanine qui est imparfaitement jumelé avec la première thymine dans la séquence catalytique DNAzyme. Le nucléotide précédant la guanine n’est pas apparié et sa méthylation protège contre le clivage Dépendant du DNAzyme. L’ARN est représenté en gris (à l’exception du site de méthylation), le DNAzyme est représenté en violet. N – n’importe quel nucléotide, R et purine : adénine ou guanine, Y et pyrimidine : cytosine ou uracil ; CH3- dénote la méthylation de l’ARN. L’appariement de base dans les séquences actives DNAzyme est marqué par des lignes pointillées. Un éclair bleu marque le site de clivage. (C) Graphique de flux montrant les étapes d’une analyse dépendante du DNAzyme. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : DNAzymes ciblant les sites de méthylation dépendants de snR13 et de snR47 dans le rRNA 25S. (A, B) Captures d’écran du navigateur montrant snR13-dépendant (A) et snR47-dépendants (B) sites de méthylation dans 25S rRNA (C) 25S séquence rRNA entourant snR13-dépendant site de méthylation (A2281) et 10-23 DNAzyme (montré en violet) conçu pour couper l’ARN entre A2281 et U2282. Un2281 n’est pas jumelé avec le DNAzyme tandis que U2282 forme une paire avec le premier nucléotide de la séquence active DNAzyme (marqué par une ligne bleue). Un éclair bleu marque le clivage. (D) séquence rRNA 25S entourant le site de méthylation dépendant de snR47 (A2220) et 8-17 DNAzyme (montré en violet) conçu pour couper l’ARN entre A2220 et G2221. Un2220 n’est pas hybride avec le DNAzyme tandis que G2221 est imparfaitement jumelé à la thymine (dénoté avec une ligne pointillée). Un éclair bleu marque le site de clivage. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Analyse de l’analyse de 2′-O-méthylation de 25S rRNA spécifique au site à l’aide de 10-23 et 8-17 d’analyse dépendante du DNAzyme. (A) Analyse de la méthylation 25S rRNA dépendante de snR13 utilisant 10-23 DNAzyme. (B) Analyse de la méthylation 25S rRNA dépendante de snR47 utilisant 8-17 DNAzyme. L’ARN a été visualisé la coloration dans un gel d’agarose dénaturant. Les produits de clivage A et B sont marqués par des flèches rouges. WT – variété de type sauvage; GAL – galactose, GLC et glucose. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

La digestion Dépendante du DNAzyme peut être utilisée comme méthode simple et rapide pour analyser l’ARN 2′-O-méthylation12,13. DNAzymes cliver ARN si le nucléotide en amont du site de clivage n’est pas méthylé. Contrairement à d’autres approches, y compris la digestion dirigée par RNase H, la dégradation alcaline ou la transcription inverse dans la faible concentration de nucléotides suivie par le PCR quantitatif ou le séquençage8,10,11 ,16, l’approche DNAzyme nécessite un oligonucléotide d’ADN simple et des réactifs de base qui sont présents dans n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire. En outre, DNAzymes peut être utilisé d’une manière similaire pour analyser la pseudouridylation de l’ARN médié par la boîte H/ACA snoRNA12, ce qui en fait des outils polyvalents dans l’étude des cibles snoRNA.

Les approches dépendantes du DNAzyme ne sont limitées que par des séquences de consensus sur le site de clivage17. 10-23 DNAzymes peuvent être utilisés pour analyser 2′-O-méthylation seulement à la position R du dinucleotide RY, tandis que 8-17 DNAzymes reconnaissent la modification du nucléotide situé en amont de la guanine. En conséquence, des modifications telles que 2′-O-méthylation du premier nucléotide dans les dinucléotides guanine-adenine (GA), adénine-adénine (AA), pyrimidine-adénine (YA) et pyrimidine-pyrimidine (YY) ne peuvent pas être analysées. En outre, la faible efficacité du clivage12 dépendant de DNAzyme devrait être considérée. Bien que certains DNAzymes clivent l’ARN presque complètement (Figure 3B), beaucoup de DNAzymes ne digèrent que partiellement leurs cibles (Figure 3B). L’efficacité peut dépendre de la séquence entourant le site de clivage. Par exemple, les régions d’ARN avec des tronçons du même nucléotide peuvent affecter le positionnement correct de la séquence active DNAzyme. En outre, les régions d’ARN formant la structure secondaire forte peuvent ré-hybrider et supprimer la liaison de DNAzyme à la séquence cible. Pour surmonter ces problèmes, des cycles de chauffage et de refroidissement du 10-23 DNAzyme et de son substrat d’ARN peuvent être appliqués18.

Nous avons utilisé l’approche DNAzyme pour étudier 2′-O-méthylation de l’ARNr. On peut également utiliser cette technique pour analyser d’autres modifications de l’ARN, telles que N6-méthyladenosine19. L’ARN ribosomal, en raison de son abondance, peut être analysé par électrophorèse et les produits de clivage peuvent être visualisés sous la lumière UV. Cependant, cela ne s’applique pas aux ARN moins abondants comme les ARN De polymère II (ARNM) et les ARN non codants (NcRNA). Ces ARN ne peuvent généralement pas être détectés directement par l’ARN colorant dans les gels d’agarose ou de polyacrylamide. Dans de tels cas, le clivage dépendant du DNAzyme peut être visualisé par le ballonnement nordique, indirectement détecté par PCR/quantitative PCR ou analysé par PCR quantitatif avec des polymères (par exemple, KlenTaq DNA Polymerase) capable de discriminer l’ARN 2o-O-méthylé de ARN non méthylé20,21.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Maya Wilson et Aneika Leney pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse Sir Henry Dale financée conjointement par le Wellcome Trust et la Royal Society (200473/Z/16/Z).

Materials

Chemicals
Acid phenol SIGMA P4682
Agarose VWR A2114
Ammonium acetate SIGMA A1542
Chlorophorm Fisher scientific 10293850
DNase/RNase free water Fischer Scientific 10526945
DNAzyme Integrated DNA Technology Custom oligo DNA
EDTA SIGMA E9884
Ethanol Absolute Fisher scientific 10437341
Formaldehyde Sigma F8775
Formamide sigma F9037
Galactose SIGMA G0750
Gel Loading Dye Thermo Fisher Scientific R0611
Glucose SIGMA G7021
Glycogen Thermo Fisher Scientific R0561
HEPES SIGMA H3375
Isoamyl SIGMA W205702
KCl SIGMA P9333
MgCl2 SIGMA M8266
MnCl2 SIGMA 244589
MOPS SIGMA M1254
NaCl SIGMA S7653
Oxoid Peptone Bacteriological Thermo Fisher Scientific LP0037
Oxoid Yeast Extract Powder Thermo Fisher Scientific LP0021
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) Thermo Fisher Scientific EO0382
SDS SIGMA 74255
Sodium acetate trihydrate SIGMA S8625
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
Tris base SIGMA TRIS-RO
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
1.5 mL microtubes Sarstedt
152VR5C01M -80°C freezer Thermo Fisher Scientific
250 mL Erlenmeyer flasks Cole-Parmer
50 mL conical tubes Sarstedt
Combicup VX200 vortex Appleton Woods
DS-11 microspectrophotometer Denovix
Electrophoresis chamber (20 cm tray) SIGMA
FiveEasy F20 pH meter Appleton Woods
Gel documentation system Syngene
Heraeus Fresco 21 micro centrifuge Fisher Scientific
Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes Fisher Scientific
Mini Fuge Plus mini centrifuge Starlab
Mixer HC thermal block Starlab
OLS26 Shaking Water Bath Grant
PowerPac power supplier BioRad
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References

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Winczura, K., Grzechnik, P. DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2’-O-Methylation. J. Vis. Exp. (151), e59700, doi:10.3791/59700 (2019).
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