تحليل تعتمد على DNAzyme من rRNA 2'-O-Methylation
Summary
هنا نقدم بروتوكول لشق DNAzyme تعتمد على RNA. وهذا يتيح التحليل السريع والمعتمد على الموقع لRNA 2′-O-methylation. ويمكن استخدام هذا النهج للتقييم الأولي أو الرئيسي لنشاط النورا.
Abstract
دليل مربع C / D RNAs النيوكليولار الصغيرة (snoRNAs) تحفيز 2′-O-ميثيليشن من ريبوسومال والحمض النووي النووي الصغير. ومع ذلك، فإن عددا كبيرا من الرنا في eukaryotes أعلى قد تعترف بشكل متقطع الأنواع الأخرى RNA و2′-O-methylate أهداف متعددة. هنا، ونحن نقدم دليل خطوة بخطوة لتحليل سريع وغير مكلفة من موقع محدد 2′-O-ميثيليشن باستخدام طريقة راسخة تستخدم oligonucleotides الحمض النووي قصيرة تسمى DNAzymes. هذه الشظايا الحمض النووي تحتوي على تسلسلات الحفازة التي تتشقق الحمض النووي الريبي في مواقف توافق ية محددة، فضلا عن الأسلحة الهومولوجيا المتغيرة توجيه DNAzyme إلى أهدافها RNA. [دنزيم] منعت نشاط ب [2-‘و-مثلأيشن] من ال [نوكليوتيد] مجاورة إلى الانقسام موقعة في ال [رنا]. وهكذا، DNAzymes، محدودة فقط من قبل توافق الآراء من تسلسل مشقق، هي أدوات مثالية للتحليل السريع للRNA بوساطة RNA 2′-O-methylation. قمنا بتحليل snRNA snR13- وsnR47-guided 2’-O-methylation من الحمض النووي الريبي 25S ribosomal في Saccharomyces cerevisiae لإظهار بساطة هذه التقنية وتوفير بروتوكول مفصل للفحص تعتمد DNAzyme.
Introduction
تلعب تعديلات الحمض النووي الريبي أدوارًا هامة في تنظيم التعبير الجيني. RNA 2′-O-methylation وpseudouridylation، التي تسترشد مربع C / D ومربع H / ACA RNAs النوكليولار الصغيرة (snoRNAs) على التوالي، وحماية الحمض النووي الريبي من التدهور وتثبيت هياكلها أعلى ترتيب1،2،3 . وقد حُددت أهداف الرنا أساساً في المناطق الرنمنة والنووية الصغيرة. ومع ذلك، في eukaryotes أعلى، وهناك يحتمل أن تكون مئات من snoRNA مع عدم وجود وظائف معينة وبعضها قد تعترف RNAs متعددة1،4،5،6،7. ولذلك، فإن الأساليب التي تسمح بتحديد وتحليل التعديلات الموجهة من قبل الرنا هي أدوات هامة في الكشف عن الآليات التي تحكم العمليات الخلوية.
يمكن تحديد موقع تحديد المعلوماتية المفترضة 2′-O-a-aaمن مربع C/D snoRNA الموجهة من قبل 2′-O-methylation وتأكيده تجريبياً من خلال العديد من التقنيات، بما في ذلك الانشقاق الموجه بـ RNase H، أو الأساليب الخاصة بالموقع والجينوم على نطاق الجينوم، والتي تستخدم النسخ العكسي في النيوكليوتيدات المنخفضة (dNTPs) نهج التركيز8،9،10،11. هذه التقنيات حساسة جدا ولكن أيضا شاقة ومكلفة، وبالتالي، قد لا تكون مناسبة للاختبار الأولي أو السريع. واحدة من أبسط ومنخفضة التكلفة طرق لتحديد 2′-O-ميثيليشن المواقع هو DNAzyme تعتمد RNA الانقسام12. DNAzymes قصيرة، واحدة تقطعت بهم السبل وجزيئات الحمض النووي النشطة الحفازة قادرة على الانقسام الاندونوكلي من الحمض النووي الريبي في مواقع محددة. وهي تتألف من تسلسل أساسي مُحفظ ونشط بشكل حفاز وأذرع ملزمة من 5 و3’، تتألف من تسلسلات متغيرة مصممة للتهجين بواسطة الاقتران الأساسي لواطسون-كريك إلى هدف الحمض النووي الريبي(الشكل 1). وهكذا، فإن الأسلحة 5 ‘و 3’ تسليم تسلسل الحفاز إلى موقع RNA محددة. وتمنع الانقسام تعتمد DNAzyme من قبل 2 ‘-O-ميثيليشن من النيوكليوتيد المتمركزة مباشرة في أعلى المنبع من موقع الانقسام12،13. وهذا يجعل DNAzymes أدوات عملية جدا لتحليل مواقع الحمض النووي الريبي المفترض أو المعروف 2′-O-methylation.
يتم استخدام نوعين من DNAzymes لتعديلات الحمض النووي الريبي تحليلات12. التسلسل النشط من 10-23 DNAzyme(الشكل 1A)يتكون من 15 النيوكليوتيدات (5’RGGCTAGCTACAACGA3′) التي تشكل حلقة حول الهدف RNA purine-pyrimidine (RY) dinucleotide وحفز الانقسام بين هذين النيوكليوتيدات. ليس ال [رنا] [بورين] ([ر]) [بس-كووووتد] مع ال [دنزيم] وال [2′-و-مثلأيشن] يقدّم على ال [دنزيم] يمنع الانقسام. الأسلحة ملزمة من 10-23 DNAzymes عادة ما تكون 10-15 النيوكليوتيدات طويلة. الفئة الثانية DNAzyme، 8-17 DNAzymes(الشكل 1B)تحتوي على 14-النيوكليوتيدات الحفاز ة تسلسل (5’TCCGAGCCGGACGA3′). النيوكليوتيدات C2،C3 و G4 زوج مع C9 G10 و G11 تشكيل هيكل حلقة الجذعية قصيرة. 8-17 DNAzymes شق الحمض النووي الريبي المنبع من أي غوانين التي يقترن بشكل ناقص مع الثيامين الأول من تسلسل DNAzyme النشطة. ال [رنا] [نوكليوتيد] [أوبّر] من ال [غنين] ليس [بس-كبينتد] مع [دنزيم] وه [2′-و-م-مثلأيشن] يضعف الانقسام. 8-17 [دنزيمس] يتطلّب [هومولوج] طويلة [أرمس] من حوالي 20 [نوكليوتيدس] أن يوجّه [دنزيم] إلى تسلسله خاصّة.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لتحليل 2′-O-ميثيليشن من rRNA في Saccharomyces cerevisiae باستخدام 10-23 و 8-17 DNAzyme تعتمد على النهج12،13 (الشكل 1C). ويمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة مع الكائنات الحية الأخرى وأنواع الحمض النووي الريبي ويستخدم للتحليلات السريعة أو الأولية أو الرئيسية لمثيلة RNA 2′-O-methylation الخاصة بالموقع.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن استخدام الهضم المعتمد على DNAzyme كطريقة بسيطة وسريعة لتحليل RNA 2′-O-methylation12,13. DNAzymes شق RNA إذا لم يتم مثيلة النيوكليوتيدات من موقع الانقسام. على النقيض من النهج الأخرى، بما في ذلك RNase H-الموجهة الهضم، والتدهور القلوي أو النسخ العكسيفي تركيز النيوكليوتيدات منخفضة تليها PCR الكمية أو التسلسل8،10،11 ،16، يتطلب نهج DNAzyme oligonucleotide الحمض النووي بسيطة والكواشف الأساسية الموجودة في أي مختبر البيولوجيا الجزيئية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام DNAzymes بطريقة مماثلة لتحليل pseudouridylation RNA بوساطة مربع H / ACA snoRNA12، مما يجعلها أدوات متعددة الاستخدامات في دراسة أهداف snoRNA.
يتم تقييد النهج المعتمدة على DNAzyme فقط من خلال تسلسل توافق الآراء موقع الانقسام17. 10-23 DNAzymes يمكن استخدامها لتحليل 2′-O-ميثيليشن فقط في موقف R من dinucleotide RY، في حين 8-17 DNAzymes تعترف بتعديل النيوكليوتيد الواقعة في المنبع من الغوانين. ونتيجة لذلك، لا يمكن تحليل التعديلات مثل 2′-O-methylation من النيوكليوتيد اتُهم في الدينوكليوتيدات غوانين-أدينين (GA)، وadenine-adenine (AA)، والبيريميدين-أدينين (YA) وبيريميدين بيريميدين (YY). وعلاوة على ذلك، ينبغي النظر في انخفاض كفاءة الانقسام المعتمد على DNAzyme12. على الرغم من أن بعض DNAzymes شق RNA تماما تقريبا (الشكل 3B)، والعديد من DNAzymes فقط جزئيا هضم أهدافها (الشكل 3B). قد تعتمد الكفاءة على التسلسل المحيط بموقع الانقسام. على سبيل المثال، قد تؤثر مناطق RNA مع امتدادات من نفس النيوكليوتيد على تحديد الموقع الصحيح للتسلسل النشط DNAzyme. وعلاوة على ذلك، قد مناطق RNA تشكيل بنية ثانوية قوية إعادة تهجين وقمع DNAzyme ملزمة للتسلسل المستهدف. للتغلب على هذه القضايا، يمكن تطبيق دورات التدفئة والتبريد من DNAzyme 10-23 والركيزة RNA18.
استخدمنا نهج DNAzyme للتحقيق 2′-O-ميثيليشن من rRNA. يمكن للمرء أيضا استخدام هذه التقنية لتحليل تعديلات الحمض النووي الريبي الأخرى، مثل N6-methyladenosine19. يمكن تحليل الحمض النووي الريبي، بسبب وفرة، عن طريق الكهربائي ويمكن تصور المنتجات الانقسام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ومع ذلك، هذا لا ينطبق على RNAs أقل وفرة مثل RNA Polymerase II-المولدة الترميز RNAs (mRNA) وغير الترميز RNAs (ncRNA). لا يمكن الكشف عن هذه RNAs عادة مباشرة عن طريق تلطيخ الحمض النووي الريبي في هلام أغاروز أو polyacrylamide. في مثل هذه الحالات، يمكن تصور الانقسام المعتمد على DNAzyme عن طريق النشاف الشمالية، التي تم الكشف عنها بشكل غير مباشر من قبل PCR / PCR الكمية أو تحليلها من قبل PCR الكمية مع البوليمرات (على سبيل المثال، KlenTaq DNA Polymerase) قادرة على التمييز 2′-O-ميثيلاتد RNA من غير ميثيل الحمض النوويالريبي 20،21.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مايا ويلسون وأنيكا ليني على القراءة النقدية للمخطوطة. وقد دعم هذا العمل زمالة السير هنري دايل التي اشترك في تمويلها صندوق ويلكوم الاستئماني والجمعية الملكية (200473/Z/16/Z).
Materials
| Chemicals | |||
| Acid phenol | SIGMA | P4682 | |
| Agarose | VWR | A2114 | |
| Ammonium acetate | SIGMA | A1542 | |
| Chlorophorm | Fisher scientific | 10293850 | |
| DNase/RNase free water | Fischer Scientific | 10526945 | |
| DNAzyme | Integrated DNA Technology | Custom oligo DNA | |
| EDTA | SIGMA | E9884 | |
| Ethanol Absolute | Fisher scientific | 10437341 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Formamide | sigma | F9037 | |
| Galactose | SIGMA | G0750 | |
| Gel Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Glucose | SIGMA | G7021 | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | R0561 | |
| HEPES | SIGMA | H3375 | |
| Isoamyl | SIGMA | W205702 | |
| KCl | SIGMA | P9333 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| MnCl2 | SIGMA | 244589 | |
| MOPS | SIGMA | M1254 | |
| NaCl | SIGMA | S7653 | |
| Oxoid Peptone Bacteriological | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| Oxoid Yeast Extract Powder | Thermo Fisher Scientific | LP0021 | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
| SDS | SIGMA | 74255 | |
| Sodium acetate trihydrate | SIGMA | S8625 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| Tris base | SIGMA | TRIS-RO | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microtubes | Sarstedt | ||
| 152VR5C01M -80°C freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 250 mL Erlenmeyer flasks | Cole-Parmer | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Combicup VX200 vortex | Appleton Woods | ||
| DS-11 microspectrophotometer | Denovix | ||
| Electrophoresis chamber (20 cm tray) | SIGMA | ||
| FiveEasy F20 pH meter | Appleton Woods | ||
| Gel documentation system | Syngene | ||
| Heraeus Fresco 21 micro centrifuge | Fisher Scientific | ||
| Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | ||
| Mini Fuge Plus mini centrifuge | Starlab | ||
| Mixer HC thermal block | Starlab | ||
| OLS26 Shaking Water Bath | Grant | ||
| PowerPac power supplier | BioRad |
References
- Dieci, G., Preti, M., Montanini, B. Eukaryotic snoRNAs: a paradigm for gene expression flexibility. Genomics. 94 (2), 83-88 (2009).
- Watkins, N. J., Bohnsack, M. T. The box C/D and H/ACA snoRNPs: key players in the modification, processing and the dynamic folding of ribosomal RNA. Wiley Interdisciplinary Review RNA. 3 (3), 397-414 (2012).
- Kufel, J., Grzechnik, P. Small Nucleolar RNAs Tell a Different Tale. Trends in Genetics. , (2018).
- Li, T., Zhou, X., Wang, X., Zhu, D., Zhang, Y. Identification and characterization of human snoRNA core promoters. Genomics. 96 (1), 50-56 (2010).
- Jorjani, H., et al. An updated human snoRNAome. Nucleic Acids Research. 44 (11), 5068-5082 (2016).
- Hubbard, T. J., et al. Ensembl 2009. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D690-D697 (2009).
- Makarova, J. A., Kramerov, D. A. SNOntology: Myriads of novel snoRNAs or just a mirage?. BMC Genomics. 12, 543 (2011).
- Yu, Y. T., Shu, M. D., Steitz, J. A. A new method for detecting sites of 2′-O-methylation in RNA molecules. RNA. 3 (3), 324-331 (1997).
- Decatur, W. A., Liang, X. H., Piekna-Przybylska, D., Fournier, M. J. Identifying effects of snoRNA-guided modifications on the synthesis and function of the yeast ribosome. Methods in Enzymology. 425, 283-316 (2007).
- Dong, Z. W., et al. RTL-P: a sensitive approach for detecting sites of 2′-O-methylation in RNA molecules. Nucleic Acids Research. 40 (20), e157 (2012).
- Birkedal, U., et al. Profiling of ribose methylations in RNA by high-throughput sequencing. Angewandte Chemie International Edition, England. 54 (2), 451-455 (2015).
- Buchhaupt, M., Peifer, C., Entian, K. D. Analysis of 2′-O-methylated nucleosides and pseudouridines in ribosomal RNAs using DNAzymes. Analytical Biochemistry. 361 (1), 102-108 (2007).
- Grzechnik, P., et al. Nuclear fate of yeast snoRNA is determined by co-transcriptional Rnt1 cleavage. Nature Communication. 9 (1), 1783 (2018).
- Piekna-Przybylska, D., Decatur, W. A., Fournier, M. J. New bioinformatic tools for analysis of nucleotide modifications in eukaryotic rRNA. RNA. 13 (3), 305-312 (2007).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18 (10), 3091-3092 (1990).
- Maden, B. E. Mapping 2′-O-methyl groups in ribosomal RNA. Methods. 25 (3), 374-382 (2001).
- Santoro, S. W., Joyce, G. F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proceedings of the National Academy of Science, U. S. A. 94 (9), 4262-4266 (1997).
- Hengesbach, M., Meusburger, M., Lyko, F., Helm, M. Use of DNAzymes for site-specific analysis of ribonucleotide modifications. RNA. 14 (1), 180-187 (2008).
- Sednev, M. V., et al. N(6) -Methyladenosine-Sensitive RNA-Cleaving Deoxyribozymes. Angewandte Chemie International Edition, England. 57 (6), 15117-15121 (2018).
- Aschenbrenner, J., Marx, A. Direct and site-specific quantification of RNA 2′-O-methylation by PCR with an engineered DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 44 (8), 3495-3502 (2016).
- Lee, K. W., Bogenhagen, D. F. Assignment of 2′-O-methyltransferases to modification sites on the mammalian mitochondrial large subunit 16 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (36), 24936-24942 (2014).
