ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

1. זנים, מדיה, מאגר מתכונים להכין מדיה שמרים (S. cerevisiae ס) כפי שמפורט להלן: YP (1% w/v תמצית שמרים, 2% w/v פאיוולוגית), ו גלוקוז ו גלקטוז מניות ב 20% w/v. הכנת הנתרן אצטט (NaAc)-EDTA (AE) מאגר כמפורט כאן: 50 mM NaAc pH 5.3 ו 10 מ”מ EDTA. הכינו 10-23 מאגר הדגירה 4x של Dנזלי מפורט כמפורט כאן: 24 mM Tris pH 8.0, 60 mM הנאל ו 10-23 מאגר התגובה 4x של Dנזאלי: 200 mM טריס pH 8.0 ו 600 מ”מ הנאל. הכינו 8-17 Dנזאלי 2x מאגר התגובה כמפורט כאן: 200 mM KCl, 800 mM הנאקל, 100 mM HEPES pH 7.0, 15 מ”מ MgCl2, ו 15 מ”מ mgcl2. הכינו מאגר מגבים 10x כמפורט להלן: 200 מ”מ בלבד, 50 mM NaAc, 1 מ”מ EDTA; pH 7.0 ו-1.5 x לדוגמה מאגר מיקוד: 50% v/v הטופס, 20% v/v פורמלדהיד, 1.5 x מאגר מגבים. השג זנים של ס. cerevisiae ס , BY4741 (מאטה His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1:: SNR13 (כמו BY4741 אבל GAL1:: SNR13: KANmX); GAL1:: SNR47 (כמו BY4741 אך GAL1:: SNR47: HIS3mX). כל זן שמרים אחרים יכול לשמש ניתוח זה. 2. עיצוב מעצבים מצא את רצף הריבית או האתר של מתילציה באמצעות מסד נתונים מתאים. עבור S. cerevisiae ס מטרות נחנה, השתמש שמרים מסדי נתונים: http://people.biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14 כדי למצוא את אתר מתילציה של עניין, למשל, snR13 תלוי באתר, בחר “snR13” ולרשום את המיקום של נוקלאוטיד שונה (למשל, snR13-מונחה A2281 ב-25 rrna). למצוא רצפים במעלה ובמורד הזרם של נוקלאוטיד שונה באמצעות מסד נתונים המתאים. עבור S. cerevisiae, השתמש במסד הנתונים של הגנום הסכקוע: https://www.yeastgenome.org/ חפש את שם הגן היעד לדוגמה, RDN25 (בקידוד 25S rRNA). מתוך “רצף” הכרטיסייה, בחר 10-15 נוקלאוטידים במעלה הזרם (5 ‘ זרוע) ו במורד הזרם (3 ‘ זרוע) של האתר מתילציה כאשר באמצעות מעבד 10-23 dנזלי ו 20 נוקלאוטידים במעלה הזרם (5 ‘ זרוע) ו במורד הזרם (3 ‘ זרוע) של האתר מתילציה עבור 8-17 dנז ליצור רצפים משלימים של 5 ‘ ו 3 ‘ זרועות. אגף 10-23 או 8-17 הרצף הקטליטי עם רצפים משלימים של 5 ‘ ו-3 ‘ זרועות. תזמיני ממני בתור דנ א רגיל. של הדנ א מהספק 3. S. cerevisiae ס תנאי צמיחה הערה: S. cerevisiae ס BY4741 נגזרות הזנים שימשו, שבו הביטוי של SNR13 או SNR47 שנחורה מונע מיזם inducible GAL1 . כדי לזרז או לעכב את הסינתזה שלהם, לגדל תאים על בינוני המכיל גלקטוז (GAL1תלויי שעתוק) או גלוקוז (שעתוק תלויGAL1). כפקד, השתמש זן סוג פראי (BY4741) גדל או על גלקטוז או גלוקוז. לגדל זנים שמרים במדיום המתאים התנאים. כדי לנתח GAL1:: SNR13 ו GAL1:: SNR47 זנים כמו גם זן מסוג פראי האיזוגניים, לגדול תאים 50 ML של מדיית YP עם 2% גלוקוז (YPD) או גלקטוז (ypgal) ב 30 ° c לשלב האקספוננציאלי האמצעי. התאים צנטריפוגה ב 1,000 x g, עבור 3 דקות ב 4 ° c. . התעלם מהעל-חושית ושמור את החבילות הקפאת כדורי תא בחנקן נוזלי ואחסן אותם ב-80 ° c.זהירות: חנקן נוזלי עלול לגרום. לכוויות מקריוגניים חמורות תמיד לובשים בגדי הגנה ומפעילים אמצעי זהירות.הערה: ניתן לאחסן את כדורי התא ב-80 ° c עד חודש. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן במידת הצורך. 4. רנ א בידוד15 הערה: השתמש בשיטה המתאימה ביותר כדי לבודד RNA. עבור שמרים S. cerevisiae ס, חם-פנול הוצאת RNA ניתן להשתמש. להוסיף 1 מ ל של מים קרים קרח, להשהות מחדש את כדורי והעברת תאים מחדש כדי 1.5 mL מיקרו צינורות. צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 10 s ב 4 ° c ולהסיר את הסופרנטאנט. הוסף 400 μL של מאגר AE והשהה מחדש את התאים.הערה: השלבים 4.4-4.15 מתבצעים בטמפרטורת החדר, אלא אם נכתב אחרת. הוסף 40 μL של 10% SDS ו 400 μL של חומצה פנול (pH 4.5).זהירות: פנול רעיל ויש לטפל. בו מתחת למכסה המנוע תמיד ללבוש חלוק מעבדה, כפפות מגן, ומשקפיים כאשר עובדים עם פנול. היפטר מפסולת בהתאם לתקנות המוסדיים. מערבבים היטב על ידי vortexing עבור 20 s. מודקון ב 65 ° c עבור 10 דקות. כל 2 דקות, בעדינות לפתוח ולסגור את הצינור כדי לשחרר את הלחץ ולהפוך את הצינור 2-3 פעמים כדי לערבב את השלבים. להעביר את הצינורות ל-80 ° c ו דגירה עבור 10 דקות. להפשיר את הצינורות על הספסל ואת צנטריפוגה ב 20,000 x g, עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את השלב העליון לצינור חדש המכיל 400 μL חומצה פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (25:24:1). אין לשבש את השלב הפנימי.זהירות: כלורופורם הוא רעיל ויש לטפל מתחת למכסה המנוע. תמיד ללבוש חלוק מעבדה, כפפות מגן, ומשקפיים כאשר עובדים עם כלורופורם. היפטר מפסולת בהתאם לתקנות המוסדיות. מערבבים היטב על ידי vortexing עבור 30 s ו צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את השלב העליון (~ 400 μL) לצינורית חדשה המכילה 400 כלורופורם μL. מערבבים היטב על ידי vortexing עבור 30 s ו צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את השלב העליון (~ 300-350 μL) לצינור חדש המכיל 1 מ ל של אטוח ו 40 μL של 7.5 M אמוניום אצטט (NH4AC). מערבבים על ידי היפוך הצינור כמה פעמים. מ80 מעלות צלזיוס עבור 2 מעלות או לילה ב-20 ° c.הערה: ניתן להשהות כאן את התהליך. צנטריפוגה ב 20,000 x g, עבור 10 דקות ב 4 ° c. קטן, גלולה לבנים RNA יהיה גלוי בתחתית הצינור. מסירים את האטואה על ידי מלטף כדי למנוע הפרעה הגלולה. הוסף 1 מ”ל של 70% אטוח ו צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר 70% אטוע על ידי ליטוף. צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 15 s ולהסיר את אטוח הנותרים עם 2-20 μl הצינורות. להשאיר את הצינור פתוח על הספסל 5 דקות לייבש את הגלולה RNA.הערה: גלולה RNA משנה את צבעו מלבן לשקוף כאשר יבש. השהה מחדש את גלולה RNA ב 30 μL של RNase/DNase-H חינם2O, להעביר את הצינור מיד על הקרח למדוד את הריכוז RNA על מיקרוספקטרוסקופיה. הקפא את הדגימות ב-20 ° c.הערה: רנ א ניתן לאחסן ב-20 ° c עד 1 לחודש ו-80 ° צ’ עד 1 עד שנה. ההליך יכול להיות מושהה כאן או המשיך ישירות לשלב הבא. 5. מינון העיכול 10-23 מינון העיכול בשנת 1.5 mL צינורות להכין מיקס דגירה על ידי שילוב של 5 μg של RNA, 200 pmol של 10-23 DNAzyme (2 μL של 100 הפתרון מניות mM) ו-2.5 μL של מאגר דגירה של 4x 10-23 בנפח כולל של 10 μL. שמרו על שפופרות קרח. להעביר את צינורות לחסום חום יבש להגדיר ב 95 ° c ו דגירה עבור 3 דקות. להעביר את הצינורות מיד על הקרח ו-דגירה עבור 5 דקות. הסתובב לזמן קצר והחזר את הצינורות בחזרה לקרח. הוסף 20 U של RNase מעכב (למשל, 0.5 μL הריבוlock RNase מעכב). מניחים את הצינורות בבלוק חום יבש להגדיר 25 ° c ו דגירה עבור 10 דקות. בינתיים, להכין תערובת תגובה ב-1.5 μL שפופרת על ידי שילוב של 5 μL של 4x 10-23 מאגר התגובה עם 4 μL של 300 מ”מ MgCl2 ו-1 Μl H2O. מניחים את הצינור בבלוק יבש מוגדר כדי 37 ° c. העבר את ערבוב הדגירה לבלוק חום יבש להגדיר עבור 37 ° צ’ ולהוסיף 10 μL של ערבוב מראש מחומם. מודיית את התגובה בשעה 37. מעלות צלזיוס לשעה אחת להעביר את הצינורות על הקרח ולהמשיך שלב 5.3.1. 8-17 מינון העיכול הכנת מיקרוtube 1.5 mL עם 5 μg של RNA בנפח כולל של 6 μL.. שמור על השפופרת על הקרח להכין מיקרוtube 1.5 mL עם 400 pmol של 8-17 DNAzyme (4 μL מתוך מניות 100 mM). . תשאיר את השפופרת על הקרח להעביר את צינורות לחסום חום יבש להגדיר עבור 95 ° c ו דגירה עבור 2 דקות. הזיזו את דגימת ה-RNA על הקרח. הסתובב בתוך הצינור עם Dנזמי עבור 5 s ו דגירה ב 25 ° c עבור 10 דקות. באותו זמן, להכין שפופרת 1.5 mL עם 10 μL של 2x 8-17 מאגר התגובה ואת הדגירה ב 25 ° c. הכינו תערובת תגובה על ידי הוספת 10 μL של מאגר התגובה מראש 2x מחומם לצינור עם DNAzyme. העבר 14 μL של תערובת התגובה לצינור עם RNA ולהוסיף 20 U של מעכב RNase. מודג את התגובה ב -25 ° c עבור 2 h. להעביר את הצינור על הקרח ולהמשיך לטיהור RNA (שלב 5.3.1). רנ א-טיהור הוסף 350 μL של מים ו 400 μL של כלורופורם לצינור התגובה, לערבב גם על ידי vortexing עבור 30 s ו צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את השלב העליון (~ 300-350 μL) לצינורית חדשה המכילה 1 מ ל של אטוח, 40 μL של 7.5 M NH4AC ו 1 μl של הגליקוגן (10 μg/μl). מערבבים על ידי היפוך הצינור כמה פעמים. מ80 מעלות צלזיוס עבור 2 מעלות או לילה ב-20 ° c.הערה: ניתן להשהות כאן את התהליך. חזור על הצעדים מ 4.15 עד 4.21. להשעות מחדש את הגלולה RNA ב 10 μL של RNase/DNase-H חינם2O ולהעביר את הצינורות מיד על הקרח. הקפא את הדגימות ב-20 ° c.הערה: רנ א ניתן לאחסן ב-20 ° c עד חודש ו-80 ° c עד שנה. ההליך יכול להיות מושהה כאן או להמשיך לאלקטרופורזה RNA. 6. רנ א אלקטרופורזה רסס את ציוד האלקטרופורזה (טנק, מגש, מסרק) עם 1% SDS, לעזוב 15 דקות ולשטוף עם הרבה של ddH2O. מתמוסס 1.5 g של agarose ב 127.5 מ ל של ddH2O על ידי לחמם אותו במיקרוגל. הוסף 15 מ ל של מגבים 10x ו 7.5 mL של 37% פורמלדהיד לפתרון agarose (הנפח הכולל הוא 150 mL).זהירות: פורמלדהיד רעיל ויש לטפל בו מתחת למכסה המנוע. תמיד ללבוש חלוק מעבדה, כפפות מגן, ומשקפיים כאשר עובדים עם פורמלדהיד. היפטר מפסולת בהתאם לתקנות המוסדיות. הוסף כמות מתאימה של כתם ג’ל הבחירה לפתרון agarose (למשל, 15 μL של SYBR בטוח ג’ל DNA כתם). מערבבים היטב ויוצקים את הצמח על מגש. הכנס מסרק לתוך הג מיד. . תשאיר את זה ל 45 דקות מתחת למכסה המנוע מכסים את המגש ברדיד אלומיניום כאשר משתמשים בכתם ג’ל רגיש לאור. הכן 600 mL של מאגר מגבים 1x. הכנה לדוגמא RNA ב שפופרת 1.5 mL, לשלב 10 μL של המדגם RNA מתעכל ומטוהרים, 5 μL של מאגר מדגם Denaturing רפתקאות ו 0.5 μL של 6x טעינת צבען.זהירות: , הטופסרעל רעיל. ויש לטפל בו מתחת למכסה המנוע תמיד ללבוש חלוק מעבדה, כפפות מגן, ומשקפיים כאשר עובדים עם הטופסלמיד. היפטר מפסולת בהתאם לתקנות המוסדיות. מודטה ה-RNA דגימות ב 70 ° c עבור 5 דקות. להעביר את הדגימות על קרח. דגירה של 5 דקות. התנדנד למטה לזמן קצר לפני טעינת ג’ל. לשים את הג במיכל האלקטרופורזה ולמלא עם מאגר מגבים 1x. טען את הנפח כולו של כל מדגם (15 μL) על ג’ל. הפעל ב 80 V עד ברומאופנול כחול מגיע 2/3 של אורך ג’ל. התמונה ג’ל באמצעות צמידה מתאים לזהות את הכתם ג’ל שנבחר (למשל, הינע UV).