Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek
Summary
Dizi özgüllüğü gen regülasyonu için çok önemlidir. Belirli dizileri tanıyan düzenleyici proteinler gen regülasyonu için önemlidir. Bu tür proteinler için fonksiyonel bağlama alanlarının tanımlanması zorlu bir biyolojik sorundur. RNA bağlayıcı protein için bağlayıcı bir alanın tanımlanması için yinelemeli bir yaklaşım burada açıklanmıştır ve tüm RNA bağlayıcı proteinler için geçerlidir.
Abstract
Gen regülasyonu tüm hücrelerde önemli bir rol oynar. Transkripsiyonel, transkripsiyon sonrası (veya RNA işleme), çevirive çeviri sonrası adımlar belirli genleri düzenlemek için kullanılır. Diziye özgü nükleik asit bağlayıcı proteinler, mekansal veya zamansal gen ekspresyonunu kontrol etmek için belirli dizileri hedef ler. Nükleik asitlerdeki bağlanma alanları tipik olarak mutasyonel analiz ile karakterizedir. Ancak, ilgi çok sayıda protein bu tür karakterizasyon için bilinen bir bağlayıcı site var. Burada RNA bağlayıcı proteinler için daha önce bilinmeyen bağlayıcı siteleri tanımlamak için bir yaklaşım açıklar. Randomize sıralı bir havuzla başlayan dizilerin yinelemeli seçimi ve amplifikasyonunu içerir. Bu adım-transkripsiyon, bağlama ve amplifikasyon-zenginleştirilmiş dizileri birkaç tur sonra tercih edilen bir bağlama site (ler) tanımlamak için sıralanır. Bu yaklaşımın başarısı in vitro bağlayıcı tahliller kullanılarak izlenir. Daha sonra, in vitro ve in vivo fonksiyonel tahliller seçilen dizilerin biyolojik alaka değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, proteine bağlı ve bağlı olmayan RNA’ları ayırmak için bir tizin bulunduğu herhangi bir RNA bağlayıcı protein için önceden bilinmeyen bir bağlayıcı sitenin(ler) tanımlanmasını ve karakterizasyonuna olanak tanır.
Introduction
Hücre biyolojisinde gen regülasyonu merkezi bir rol oynar. Gen ekspresyonu yolu boyunca bir veya birden fazla adımda genler düzenlenme potansiyeline sahiptir. Bu adımlar transkripsiyon (başlatma, uzama ve sonlandırma) yanı sıra birleştirme, poliadenilasyon veya 3′ bitiş oluşumu, RNA ihracat, mRNA çeviri ve birincil transkript çürüme / lokalizasyon içerir. Bu adımlarda, nükleik asit bağlayıcı proteinler gen regülasyonlarını modüle eder. Bu tür proteinler için bağlayıcı alanların belirlenmesi gen kontrolü eğitiminin önemli bir yönüdür. Mutasyonel analiz ve filogenetik dizi karşılaştırması, promotörler, splice siteleri, poliadenilasyon elemanları ve çeviri sinyalleri 1 gibi nükleik asitlerdeki düzenleyici dizileri veya protein bağlayıcı alanları keşfetmek için kullanılmıştır1, 2.000 , 3.2.2 , 4 .
Pre-mRNA birleştirme gen ekspresyonu ve regülasyonu sırasında ayrılmaz bir adımdır. Memeli genlerinin çoğunda, insanlarda da dahil olmak üzere, intronlar vardır. Bu transkriptlerin büyük bir kısmı alternatif olarak birleştirilmiş olup, aynı gen veya primer transkriptten birden fazla mRNA ve protein isoformları üretilir. Bu isoformların hücre biyolojisinde hücreye özgü ve gelişimsel rolleri bulunur. 5′ splice sitesi, şube noktası ve polipirimidin-yolu/3′ splice sitesi, yönetmeliğe tabi kritik birleştirme sinyalleridir. Olumsuz düzenlemede, başka bir şekilde güçlü bir splice sitesi bastırılır, olumlu düzenlemede ise zayıf bir splice sitesi etkinleştirilir. Bu olayların bir kombinasyonu işlevsel olarak farklı isoforms bir bolluk üretir. RNA bağlayıcı proteinler bu alternatif birleştirme olaylarında kilit rol oynarlar.
Çok sayıda protein olan bağlayıcı site (ler) veya RNA hedefleri5,6tespit edilecektir bilinmektedir. Düzenleyici proteinleri aşağı biyolojik hedeflerine veya dizilerine bağlamak genellikle karmaşık bir süreçtir. Bu tür proteinler için, hedef RNA veya bağlayıcı sitenin belirlenmesi biyolojik fonksiyonlarını tanımlamada önemli bir adımdır. Bağlayıcı bir bölge tanımlandıktan sonra, standart moleküler ve biyokimyasal analizler kullanılarak daha da karakterize edilebilir.
Burada açıklanan yaklaşımın iki avantajı vardır. İlk olarak, ilgi bir protein için daha önce bilinmeyen bir bağlayıcı site belirleyebilirsiniz. İkinci olarak, bu yaklaşımın bir avantajı da aynı anda doygunluk mutagenezi sağlar, aksi takdirde ciltleme site içinde dizi gereksinimleri hakkında karşılaştırılabilir bilgi elde etmek için emek yoğun olacaktır. Böylece, RNA protein bağlayıcı siteleri tanımlamak için daha hızlı, daha kolay ve daha az maliyetli bir araç sunuyor. Başlangıçta, bu yaklaşım (EXponential zenginleştirme ile Ligands Sistematik Evrimi) bakteriyofaj T4 DNA polimeraz (gen 43 protein), kendi mRNA ribozom bağlayıcı site ile örtüşen bağlayıcı site için bağlayıcı site karakterize etmek için kullanılmıştır. Bağlama sitesi,analiz7 için 65.536 randomize varyantı temsil eden 8-baz döngü dizisi içerir. İkinci olarak, yaklaşım da bağımsız olarak farklı boyalar için belirli bağlama siteleri veya aptamers yaklaşık 1013 dizileri8bir havuzdan seçilebilir göstermek için kullanılmıştır. Aslında, bu yaklaşım geniş birçok farklı bağlamlarda aptamers tanımlamak için kullanılmıştır (RNA veya DNA dizileri) proteinler gibi çok sayıda ligands bağlamak için, küçük moleküller, ve hücreler, ve kataliz için9. Örnek olarak, bir aptamer kafein 10 bir metil grubunun varlığı ile farklı iki ksantin türevleri,kafein ve teofilin arasında ayrım yapabilirsiniz. Bu yaklaşımı (SELEX veya yinelemeli seçilim-amplifikasyon) aşağıdaki tartışmanın temelini oluşturacak olan RNA bağlayıcıproteinlerin 11’i birleştirme veya birleştirme düzenlemesinde nasıl işlediğini incelemek için yoğun olarak kullandık.
Rasgele kütüphane: Biz 31 nükleotit rasgele bir kütüphane kullanılır. Rasgele kitaplık için uzunluk dikkate gevşek genel birleştirme faktörü U2AF65 dal noktası sırası ve 3 ‘splice site arasında bir dizi bağlanır fikrine dayanıyordu. Ortalama olarak, metazoanlarda bu birleştirme sinyalleri arasındaki boşluk 20 ila 40 nükleotit aralığındadır. Başka bir protein Sex-lethal hedef öncesi mRNA, transformatör3 ‘splice site yakınında kötü karakterize düzenleyici dizi bağlamak için biliniyordu . Böylece, PCR amplifikasyonu ve in vitro transkripsiyon için T7 RNA polimeraz organizatörü ek için izin vermek için restriksiyon enzim siteleri ile astar bağlama siteleri ile çevrili 31 nükleotit, rasgele bir bölge seçti. Teorik kütüphane boyutu veya karmaşıklığı 431 veya yaklaşık 1018idi. Biz aşağıda açıklanan deneyler için rasgele RNA havuzu (~ 1012-1015)hazırlamak için bu kütüphanenin küçük bir kısmını kullandı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nükleik asit bağlayıcı proteinler hayvan ve bitki gelişiminin önemli düzenleyicileridir. SELEX prosedürü için önemli bir gereklilik protein bağlı ve bağlı olmayan RNA fraksiyonları ayırmak için kullanılabilecek bir titregeliştirilmesidir. Prensip olarak, bu töz filtre bağlayıcı tayoz, jel hareketlilik kayması tsay veya rekombinant proteinler, saflaştırılmış proteinler veya protein kompleksleri için bir matris bağlayıcı tsay19 gibi bir in vitro bağlayıcı tsay ol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazar, geçmiş fon için Ulusal Sağlık Enstitüleri teşekkür eder.
Materials
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3′ end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5′-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. , (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F. Reflections of a Darwinian Engineer. Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al. RAPID-SELEX for RNA aptamers. PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al. The in vitro selection world. Methods. 106, 3-13 (2016).
