Esplorare lo spazio di sequenza per identificare i siti di legame per le proteine di legame dell'RNA regolamentare

Nella biologia cellulare, la regolazione genica svolge un ruolo centrale. A uno o più passaggi lungo il percorso di espressione genica, i geni hanno il potenziale per essere regolati. Questi passaggi includono la trascrizione (iniazione, allungamento e terminazione) così come lo splicing, la poliadenilazione o la formazione finale di 3′ , l’esportazione dell’RNA, la traduzione di mRNA e il decadimento/localizzazione delle trascrizioni primarie. In questi passaggi, le proteine che legano l’acido nucleico modulano la regolazione genica. L’identificazione dei siti di legame per tali proteine è un aspetto importante dello studio del controllo genico. L’analisi mutazionale e il confronto della sequenza filogenetica sono stati utilizzati per scoprire sequenze normative o siti di legame proteico in acidi nucleici, come promotori, siti di giunzione, elementi di poliadenilazione e segnali traslazionali^{1, 2 Il} nome del sistema ^{, 3} (COM del nome ^{, 4}.

Lo splicing pre-mRNA è un passo fondamentale durante l’espressione e la regolazione genica. La maggior parte dei geni dei mammiferi, compresi quelli negli esseri umani, hanno introni. Una grande frazione di queste trascrizioni è alternativamente spliced, producendo più isoforme mRNA e proteine dallo stesso gene o trascrizione primaria. Queste isoforme hanno ruoli specifici delle cellule e di sviluppo nella biologia cellulare. Il sito di giunzione da 5′ , il punto di rammarico e il sito di giunzione polipirina/3′ sono segnali critici di giunzione che sono soggetti a regolamentazione. Nella regolazione negativa, un sito di giunzione altrimenti forte viene represso, mentre nella regolamentazione positiva viene attivato un sito di giunzione altrimenti debole. Una combinazione di questi eventi produce una pletora di isoforme funzionalmente distinte. Le proteine che legano l’RNA svolgono un ruolo chiave in questi eventi alternativi di giunzione.

Sono note numerose proteine i cui siti di legame o bersagli di RNA devono ancora essere identificati^5,6. Collegare le proteine regolatorie ai loro bersagli o sequenze biologiche a valle è spesso un processo complesso. Per tali proteine, l’identificazione dell’RNA bersaglio o del sito di legame è un passo importante nella definizione delle loro funzioni biologiche. Una volta identificato, un sito di legame può essere ulteriormente caratterizzato utilizzando analisi molecolari e biochimiche standard.

L’approccio qui descritto presenta due vantaggi. In primo luogo, può identificare un sito di legame precedentemente sconosciuto per una proteina di interesse. In secondo luogo, un ulteriore vantaggio di questo approccio è che consente contemporaneamente la mutagenesi della saturazione, che altrimenti richiederebbe molta manodopera per ottenere informazioni comparabili sui requisiti di sequenza all’interno del sito di rilegatura. Così, offre uno strumento più veloce, più facile e meno costoso per identificare i siti di legame proteico nell’RNA. Originariamente, questo approccio (SELEX o evoluzione sistematica dei ligandi da arricchimento EXponential) è stato utilizzato per caratterizzare il sito di legame per la polioamerasi del DNA batteriophage T4 (proteina genica 43), che si sovrappone al sito di legame del ribosoma nel proprio mRNA. Il sito di associazione contiene una sequenza di loop a 8 basi, che rappresenta 65.536 varianti randomizzate per l’analisi⁷. In secondo luogo, l’approccio è stato utilizzato anche in modo indipendente per dimostrare che specifici siti di legame o aptamers per diversi coloranti possono essere selezionati da un pool di circa 10¹³ sequenze⁸. Infatti, questo approccio è stato ampiamente utilizzato in molti contesti diversi per identificare gli aptamers (sequenze di RNA o DNA) per legare numerosi ligandi, come proteine, piccole molecole e cellule, e per la catalisi⁹. Ad esempio, un aptamer può discriminare tra due derivati xanthine, caffeina e teofillina, che differiscono per la presenza di un gruppo metilico nella caffeina¹⁰. Abbiamo ampiamente usato questo approccio (SELEX o selezione iterativa-amplificazione) per studiare come funzionano le proteine che legano l’RNA nella regolazione dello splicing o dello splicing¹¹, che sarà la base per la discussione qui sotto.

La libreria casuale: Abbiamo usato una libreria casuale di 31 nucleotidi. La considerazione della lunghezza per la libreria casuale era vagamente basata sull’idea che il fattore di giunzione generale U2AF⁶⁵ si lega a una sequenza tra la sequenza di branch-point e il sito di giunzione 3′. In media, la spaziatura tra questi segnali di splicing nei metazoi è compresa tra 20-40 nucleotidi. Un’altra proteina Sex-lethal era nota per legarsi a una sequenza regolatore mal caratterizzata vicino al sito di giunzione 3′ del suo pre-mRNA bersaglio, trasformatore. Così, abbiamo scelto una regione casuale di 31 nucleotidi, affiancata da siti di legame primer con siti di enzimi di restrizione per consentire l’amplificazione PCR e l’attaccamento del promotore di polimerasi t7 RNA per la trascrizione in vitro. La dimensione teorica della biblioteca o la complessità era di 4³¹ o di circa 10¹⁸. Abbiamo usato una piccola frazione di questa libreria per preparare ilnostro pool di RNA casuale (10¹²-15 dollari) per gli esperimenti descritti di seguito.