استكشاف مساحة التسلسل لتحديد مواقع الربط للبروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي التنظيمية
Summary
خصوصية التسلسل أمر بالغ الأهمية لتنظيم الجينات. البروتينات التنظيمية التي تعترف تسلسل معين مهمة لتنظيم الجينات. إن تحديد مواقع الربط الوظيفي لهذه البروتينات يمثل مشكلة بيولوجية صعبة. ويرد هنا وصف لنهج تكراري لتحديد موقع ملزم لبروتين ملزم بالحمض النووي الريبي، وهو ينطبق على جميع البروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي.
Abstract
يلعب تنظيم الجينات دورًا هامًا في جميع الخلايا. يتم استخدام خطوات النسخ، وما بعد النسخ (أو معالجة الحمض النووي الريبي)، والترجمة، وخطوات ما بعد الترجمة لتنظيم جينات محددة. تستهدف البروتينات الملزمة بالحمض النووي الخاصة بالتسلسل تسلسلات محددة للتحكم في التعبير الجيني المكاني أو الزمني. تتميز مواقع الربط في الأحماض النووية عادة بتحليل الطفرة. ومع ذلك، فإن العديد من البروتينات ذات الأهمية ليس لها موقع ملزم معروف لمثل هذا الوصف. هنا نقوم بوصف نهج لتحديد مواقع الربط غير معروف سابقا للبروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي. وهو ينطوي على اختيار تكراري وتضخيم تسلسل بدءا من تجمع تسلسل معشاة. بعد عدة جولات من هذه الخطوات النسخ، ملزمة، وتضخيم-تسلسل المخصب يتم تسلسل لتحديد موقع (مواقع) ملزمة المفضلة. يتم رصد نجاح هذا النهج باستخدام الاختبارات الملزمة في المختبر. وفي وقت لاحق، يمكن استخدام الاختبارات الوظيفية في المختبر وفي الجسم الحي لتقييم الأهمية البيولوجية للتسلسلات المختارة. ويسمح هذا النهج بتحديد وتوصيف موقع (مواقع) ملزمة لم تكن معروفة من قبل لأي بروتين ملزم بالحمض النووي الريبي الذي يوجد له أي وصف لفصل RNAs المرتبط بالبروتين وغير المنضم.
Introduction
في بيولوجيا الخلايا، تنظيم الجينات يلعب دورا مركزيا. في خطوة واحدة أو خطوات متعددة على طول مسار التعبير الجيني، الجينات لديها القدرة على تنظيمها. وتشمل هذه الخطوات النسخ (بدء، استطالة، وإنهاء) فضلا عن الربط، polyadenylation أو 3 ‘تشكيل نهاية، تصدير الحمض النووي الريبي، وترجمة mRNA، والاضمحلال / توطين النصوص الأولية. في هذه الخطوات، البروتينات الملزمة بالحمض النووي تعدل تنظيم الجينات. تحديد المواقع الملزمة لهذه البروتينات هو جانب مهم من دراسة السيطرة على الجينات. وقد استخدمت تحليل الطفرات ومقارنة التسلسل الجيني لاكتشاف التسلسل التنظيمي أو مواقع ربط البروتين في الأحماض النووية، مثل المروجين، ومواقع لصق، وعناصر تعدد الإنكار، وإشارات الترجمة1، 2 , 3 , 4.
الربط قبل mRNA هو خطوة لا تتجزأ خلال التعبير الجيني والتنظيم. غالبية جينات الثدييات، بما في ذلك تلك الموجودة في البشر، لديها الإنترونات. جزء كبير من هذه النصوص هو بدلا من ذلك لصقها، مما أدى إلى عدة الحمض النووي الريبي والبروتين isoforms من نفس الجينات أو النص الأولي. هذه الإيزوفورمات لها أدوار محددة الخلية والتنموية في بيولوجيا الخلايا. موقع الربط 5’، ونقطة الفرع، وموقع الربط polypyrimidine-tract/3′ هي إشارات الربط الحرجة التي تخضع للتنظيم. في تنظيم سلبيّة, خلاف ذلك قوّيّة لصق موقعة قمعت, بينما في نظام تعديل إيجابيّة ضعيفة لصق موقعة يكون تنشيطت. مزيج من هذه الأحداث تنتج مجموعة كبيرة من isoforms متميزة وظيفيا. تلعب البروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي أدوارًا رئيسية في أحداث الربط البديلة هذه.
ومن المعروف العديد من البروتينات التي لا يزال من المقرر تحديد مواقعها الملزمة أو أهداف الحمض النووي الريبي5و6. وكثيرا ً ما يكون ربط البروتينات التنظيمية بأهدافها أو تسلسلاتها البيولوجية في المراحل النهائية عملية معقدة. وبالنسبة لهذه البروتينات، فإن تحديد الحمض النووي الريبي المستهدف أو موقع الربط هو خطوة هامة في تحديد وظائفها البيولوجية. وبمجرد تحديد موقع ملزم، يمكن زيادة وصفه باستخدام التحليلات الجزيئية والكيميائية الحيوية القياسية.
وللنهج الموصوف هنا ميزتان. أولا، فإنه يمكن تحديد موقع ربط غير معروف سابقا لبروتين من الفائدة. ثانياً، هناك ميزة إضافية لهذا النهج هي أنه يسمح في الوقت نفسه بتحول التشبع، الذي لولا ذلك لكان كثيف العمالة للحصول على معلومات قابلة للمقارنة حول متطلبات التسلسل داخل موقع الربط. وبالتالي، فإنه يوفر أداة أسرع وأسهل وأقل تكلفة لتحديد مواقع ربط البروتين في RNA. في الأصل، تم استخدام هذا النهج (SELEX أو التطور المنهجي للأربطة من قبل إثراء EXponential) لوصف موقع ملزم للبكتيريا T4 DNA polymerase (الجينات 43 البروتين)، الذي يتداخل مع موقع ربط ريبوسوم في mRNA الخاصة به. يحتوي موقع الربط على تسلسل حلقة 8-قاعدة، يمثل 65,536 متغير معشاة للتحليل7. ثانياً، استُخدم هذا النهج أيضاً بشكل مستقل لإظهار أنه يمكن اختيار مواقع ربط محددة أو aptamers لأصباغ مختلفة من مجموعة من حوالي 1013 تسلسل8. في الواقع، وقد استخدم هذا النهج على نطاق واسع في العديد من السياقات المختلفة لتحديد aptamers (RNA أو تسلسل الحمض النووي) لربط العديد من ligands، مثل البروتينات والجزيئات الصغيرة، والخلايا، وللحفز9. على سبيل المثال، يمكن أن تميز aptamer بين اثنين من مشتقات الزانثين، الكافيين والثيوفيلين، والتي تختلف من خلال وجود مجموعة الميثيل واحدة في الكافيين10. لقد استخدمنا هذا النهج على نطاق واسع (SELEX أو التكراري اختيار التضخيم) لدراسة كيفية عمل البروتينات الملزمة RNA في الربط أو الربط اللائحة11، والتي ستكون الأساس للمناقشة أدناه.
المكتبة العشوائية: استخدمنا مكتبة عشوائية من 31 نيوكليوتيدات. واستند النظر في طول المكتبة العشوائية بشكل فضفاض على فكرة أن عامل الربط العام U2AF65 يرتبط بتسلسل بين تسلسل نقطة الفرع وموقع الربط 3. في المتوسط، والتباعد بين هذه الإشارات الربط في الميتازوانات هو في نطاق 20 إلى 40 النيوكليوتيدات. ومن المعروف بروتين آخر الجنس القاتلة لربط تسلسل التنظيمية سيئة تتميز بالقرب من موقع لصق 3 ‘من الهدف قبل mRNA، محول. وهكذا، اخترنا منطقة عشوائية من 31 النيوكليوتيدات، وتحيط بها مواقع الربط التمهيدي مع مواقع إنزيم تقييد للسماح لتضخيم PCR والتعلق من T7 RNA بوليميراز المروج للنسخ في المختبر. كان حجم المكتبة النظرية أو تعقيد431 أو ما يقرب من 1018. استخدمنا جزء صغير من هذه المكتبة لإعداد تجمع الحمضالنووي الريبي العشوائي لدينا (~ 10 12-1015)للتجارب الموضحة أدناه.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتينات الملزمة بالأحماض النووية هي جهات تنظيمية هامة لتنمية الحيوانات والنباتات. أحد المتطلبات الرئيسية لإجراء SELEX هو تطوير الفحص الذي يمكن استخدامه لفصل كسور الحمض النووي الريبي المرتبطة بالبروتين وغير المنضمة. من حيث المبدأ، يمكن أن يكون هذا الفحص في المختبر فحص ملزمة مثل الفحص مل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر صاحب البلاغ المعاهد الوطنية للصحة على تمويلها السابق.
Materials
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3′ end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5′-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. , (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F. Reflections of a Darwinian Engineer. Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al. RAPID-SELEX for RNA aptamers. PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al. The in vitro selection world. Methods. 106, 3-13 (2016).
