סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה
Summary
הספציפיות לרצף היא קריטית. לתקנות הגנים חלבונים רגולטוריות המכירים רצפים ספציפיים חשובים עבור רגולציה גנטית. הגדרת אתרי קשירה פונקציונליים עבור חלבונים כאלה היא בעיה ביולוגית מאתגרת. גישה איטראטיבית לזיהוי של אתר מחייב עבור חלבון של איגוד RNA מתוארת כאן וישימה לכל החלבונים מבוססי RNA.
Abstract
רגולציה של ג’ין ממלאת תפקיד חשוב בכל התאים. ההמרה, לאחר ההמרה (או עיבוד RNA), הטרנסלtional והשלבים שלאחר ההעברה משמשים לוויסות גנים ספציפיים. ספציפי לרצף חומצות גרעין-מחייב חלבונים היעד רצפים ספציפיים לשלוט ביטוי גנים מרחביים או זמני. אתרי הכריכה בחומצות גרעין מאופיינים בדרך כלל בניתוחי מבצעים. עם זאת, לחלבונים רבים של עניין אין אתר מחייב ידוע לאפיון כזה. כאן אנו מתארים גישה כדי לזהות אתרי איגוד לא ידועים בעבר עבור חלבונים כריכת RNA. היא כוללת בחירה איטרטיבית והגברה של רצפים החל במאגר רצף אקראי. בעקבות מספר סיבובים של צעדים אלה-תמלול, כריכה והגברה-הרצפים המועשרת מנצנצים כדי לזהות אתרי איגוד מועדפים. הצלחה בגישה זו מפוקחת על ידי שימוש באיגוד מתורבת. לאחר מכן, בתוך מבחנה ובvivo פונקציונלי ניתן להשתמש כדי להעריך את הרלוונטיות הביולוגית של הרצפים שנבחרו. גישה זו מאפשרת זיהוי ואפיון של אתר מחייב שאינו ידוע בעבר עבור כל חלבון של איגוד RNA שעבורו קיים שיטה להפריד בין מאוגד לחלבון וללא מאוגד.
Introduction
בביולוגיה של התאים, רגולציה. גנטית ממלאת תפקיד מרכזי באחד או מספר שלבים לאורך מסלול ביטוי הגן, גנים יש את הפוטנציאל להיות מוסדר. שלבים אלה כוללים תמלול (ייזום, התארכות וסיום), כמו גם שחבור, פוליאדלציה או 3 ‘ היווצרות בסוף, RNA ייצוא, התרגום mRNA, ו ריקבון/לוקליזציה של תעתיקים העיקרי. בשלבים אלה, חומצות גרעין מחייב חלבונים לווסת את רגולציה גנים. זיהוי של אתרי איגוד עבור חלבונים כאלה הוא היבט חשוב של לימוד בקרת גנים. ניתוח מועד והשוואת הרצף פילוגנטי שימשו כדי לגלות רצפי רגולציה או מחייב חלבונים אתרים בחומצות גרעין, כגון היזמים, אחוי אתרים, מרכיבים פוליאדלציה, ואותות טרנסלtional1, מיכל השני , מיכל שלוש , ד.
שחבור טרום-mRNA הוא צעד אינטגרלי במהלך ביטוי גנים ורגולציה. רוב הגנים המיונקים, כולל אלה בבני האדם, יש היפוגנים. חלק גדול של התעתיקים האלה הוא לחילופין משולב, הפקת מספר mrna ו איזופורמים חלבון מאותו גן או תעתיק ראשוני. איזוטפסים אלה הם בעלי תפקידים ספציפיים לתאים והתפתחותיים בביולוגיה של התא. האתר של 5 ‘ אחוי, נקודת ההסתעפות, והאתר הנמצא במערכת העיכול/3, מהווה אותות קריטיים הכפופים לרגולציה. בתקנה שלילית, האתר החזק ביותר במקום הוא מודחק, ואילו בתקנה חיובית האתר מופעל בצורה אחרת. שילוב של אירועים אלה מייצר שפע של איזוטפסים ברורים מבחינה פונקציונלית. כריכת ה-RNA חלבונים לשחק תפקידים מרכזיים אלה שחבור האירועים החלופיים.
חלבונים רבים ידועים כאשר האתרים המחייבים (s) או יעדי RNA נשארים להיות מזוהים5,6. קישור חלבונים רגולטוריות למטרות ביולוגיות שלהם במטה או רצפים הוא לעתים קרובות תהליך מורכב. עבור חלבונים כאלה, זיהוי של היעד שלהם RNA או מחייב אתר הוא צעד חשוב בהגדרת פונקציות ביולוגיות שלהם. לאחר מזוהה אתר מחייב, זה יכול להיות מאופיין עוד באמצעות ניתוחים מולקולריים סטנדרטיים ביוכימיים.
לגישה המתוארת כאן יש שני יתרונות. ראשית, הוא יכול לזהות אתר מחייב לא ידוע בעבר עבור חלבון של עניין. שנית, יתרון נוסף של גישה זו הוא שהוא מאפשר בו זמנית מוטזיס רוויה, שאחרת תהיה עבודה אינטנסיבית להשגת מידע דומה על דרישות הרצף בתוך אתר האיגוד. כך, הוא מציע כלי מהיר, קל יותר, פחות יקר לזהות אתרי כריכת חלבון ב-RNA. במקור, גישה זו (SELEX או האבולוציה שיטתית של ליגנדס על ידי העשרה מעריכית) שימש כדי לאפיין את האתר מחייב עבור בקטיוגה T4 DNA פולימראז (הגן 43 חלבון), אשר חופף עם האתר המחייב הריבוכמה ב-mRNA שלה. אתר הכריכה מכיל רצף לולאה של 8 בסיסים, המייצג 65,536 גרסאות אקראיים לניתוח7. שנית, הגישה השתמשה גם באופן עצמאי כדי להראות כי אתרים מסוימים מחייב או aptamers עבור צבעים שונים ניתן לבחור מתוך בריכה של כ 1013 רצפים8. למעשה, גישה זו היתה בשימוש נרחב בהקשרים שונים רבים כדי לזהות aptamers (RNA או רצפי DNA) עבור כריכת ליגנדס רבים, כגון חלבונים, מולקולות קטנות, תאים, ועבור מזרז9. כדוגמה, aptamer אלף יכול להפלות בין שתי הנגזרות האלה, קפאין ו-הפסלין, אשר שונים על ידי נוכחות של קבוצת מתיל אחד בקפאין10. השתמשנו בהרחבה בגישה זו (SELEX או הגברה בחירה איטראטיבית) כדי ללמוד כיצד להשתמש בחלבונים מבוססי RNA הפועלים באמצעות שחבור או בתקנה11, אשר יהיה הבסיס לדיון להלן.
הספרייה האקראית: השתמשנו בספריה אקראית של 31 נוקלאוטידים. השיקול האורך עבור הספרייה האקראית היה מבוסס באופן רופף על הרעיון כי הU2AF הכללית גורם השחבור65 נקשר לרצף בין רצף נקודת ההסתעפות לבין 3 ‘ אחוי האתר. בממוצע, המרווח בין האותות האלה במטזואים הוא בטווח של 20 עד 40 נוקלאוטידים. חלבון אחר סקס-קטלני היה ידוע לאגד רצף הרגולציה מאופיין גרוע ליד 3 ‘ אחוי האתר של היעד שלה pre-mRNA, שנאי. כך, בחרנו אזור אקראי של 31 נוקלאוטידים, מוקף באתרי כריכה פריימר עם אתרי אנזים הגבלה כדי לאפשר הגברה PCR והחזקה של היזם T7 RNA פולימראז עבור שעתוק מבחנה. גודל הספרייה התיאורטית או המורכבות היה 431 או כ-1018. השתמשנו בחלק קטן של הספרייה הזאת כדי להכין את בריכת ה-RNA האקראית שלנו (~ 10-12-1015) עבור הניסויים המתוארים להלן.
Protocol
Representative Results
Discussion
חומצות גרעין מחייב חלבונים הם הרגולטורים חשובים של בעלי חיים ופיתוח הצמח. דרישה מרכזית עבור הליך SELEX היא התפתחות של מעשה שניתן להשתמש בו כדי להפריד שברים RNA בעלי מאוגד חלבון ובלתי מאוגד. בעיקרון, היכולת הזאת יכולה להיות בתוך שיטת מחייב מחוץ לחוק, כגון השילוב של איגוד המסננים, שיטת התזוזה של …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחבר מודה למוסדות הבריאות הלאומיים למימון העבר.
Materials
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3′ end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5′-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. , (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F. Reflections of a Darwinian Engineer. Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al. RAPID-SELEX for RNA aptamers. PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al. The in vitro selection world. Methods. 106, 3-13 (2016).
