Explorando o espaço de seqüência para identificar sites de vinculação para proteínas reguladoras de ligação de RNA

Na biologia celular, a regulação gênica desempenha um papel central. Em uma ou várias etapas ao longo da via de expressão gênica, os genes têm o potencial para ser regulado. Estas etapas incluem a transcrição (iniciação, alongamento, e terminação) assim como a emenda, a poliadenilação ou a formação final de 3 ‘, a exportação do RNA, a tradução do mRNA, e a deterioração/localização de transcritos preliminares. Nestas etapas, as proteínas de ligação ácida nucleico modulam a regulação genética. A identificação de sítios de ligação para essas proteínas é um aspecto importante do estudo do controle genético. A análise mutacional e a comparação da sequência filogenética têm sido usadas para descobrir sequências regulatórias ou sítios de ligação protéica em ácidos nucleicos, como promotores, sítios de emenda, elementos de poliadenilação e sinais translacionais^{1, 2. º , 3. º ,} a ⁴.

A emenda do pre-mRNA é uma etapa integral durante a expressão e a regulação do gene. A maioria dos genes mamíferos, incluindo aqueles em seres humanos, têm introns. Uma grande fração destas transcrições é alternativamente emunida, produzindo o mRNA múltiplo e as isoformas da proteína do mesmo gene ou transcrição preliminar. Essas isoformas têm funções específicas de células e de desenvolvimento na biologia celular. O 5 ‘ Splice site, o ramo-ponto, e o polypyrimidine-Tract/3 ‘ Splice site são críticos de emenda de sinais que estão sujeitos a regulamentação. No Regulamento negativo, um local de outra maneira forte da tala é reprimido, visto que no Regulamento positivo um local de outra maneira fraco da tala é ativado. Uma combinação desses eventos produz uma infinidade de isoformas funcionalmente distintas. As proteínas de ligação ao RNA desempenham papéis-chave nestes eventos alternativos de splicing.

As proteínas numerosas são conhecidas cujos os alvos do local (s) ou do RNA da ligação permanecem ser identificados^5,6. Ligar as proteínas reguladoras aos seus alvos biológicos a jusante ou sequências é frequentemente um processo complexo. Para essas proteínas, a identificação de seu RNA alvo ou local de ligação é um passo importante na definição de suas funções biológicas. Uma vez que um local obrigatório é identificado, pode ser caracterizado mais mais usando análises moleculars e bioquímicas padrão.

A abordagem descrita aqui tem duas vantagens. Primeiramente, pode identificar um local previamente desconhecido da ligação para uma proteína do interesse. Em segundo lugar, uma vantagem adicional desta aproximação é que permite simultaneamente a mutagenese da saturação, que de outra maneira seria labor intensivo para obter a informação comparável sobre exigências da seqüência dentro do local obrigatório. Assim, oferece uma ferramenta mais rápida, mais fácil, e menos cara para identificar locais da ligação da proteína no RNA. Originalmente, essa abordagem (SELEX ou evolução sistemática dos ligantes por enriquecimento exponencial) foi utilizada para caracterizar o local de ligação para o bacteriófago T4 DNA polymerase (Gene 43 protein), que se sobrepõe ao local de ligação Ribossome em seu próprio mRNA. O site de vinculação contém uma sequência de loop de 8-base, representando 65.536 variantes aleatórias para análise⁷. Em segundo lugar, a abordagem também foi usada de forma independente para mostrar que locais de ligação específicos ou aptâmeros para diferentes corantes podem ser selecionados a partir de um pool de aproximadamente 10¹³ sequências⁸. Na verdade, essa abordagem tem sido amplamente utilizada em muitos contextos diferentes para identificar aptâmeros (seqüências de RNA ou DNA) para ligar numerosos ligantes, tais como proteínas, pequenas moléculas e células, e para catálise⁹. Como exemplo, um aptâmeros pode discriminar entre dois derivados de xantina, cafeína e Teofilina, que diferem pela presença de um grupo metilo na cafeína¹⁰. Nós usamos extensivamente esta aproximação (Selex ou seleção-amplificação iterativo) para estudar como as proteínas RNA-obrigatórias funcionam na emenda ou na regulação de emenda¹¹, que será a base para a discussão abaixo.

A biblioteca aleatória: nós usamos uma biblioteca aleatória de 31 nucleotides. A consideração de comprimento para a biblioteca aleatória foi vagamente baseada na idéia de que o fator de emenda geral U2AF⁶⁵ vincula a uma seqüência entre a seqüência de ponto de ramificação e o site de Splice 3 ‘. Em média, o espaçamento entre esses sinais de splicing em metazoanos está na faixa de 20 a 40 nucleotídeos. Uma outra proteína sexo-letal era sabido para ligar a uma seqüência regulamentar mal caracterizada perto do 3 ‘ local da tala de seu alvo pre-mRNA, transformador. Assim, optou-se por uma região aleatória de 31 nucleotídeos, ladeada por sítios de encadernação com sítios enzimáticos de restrição para permitir a amplificação de PCR e a fixação do promotor de RNA polimerase T7 para transcrição in vitro. O tamanho ou complexidade teórico da biblioteca foi de 4³¹ ou aproximadamente 10¹⁸. Utilizamos uma pequena fração desta biblioteca para preparar nosso pool de RNA aleatório (~ 10¹²-10¹⁵) para os experimentos descritos abaixo.