In vitro transkripsiyonu RNA tabanlı luciferase Reporter assay Poxvirus-virüslü hücrelerde çeviri Yönetmeliği çalışma
Summary
Biz poxvirus enfekte hücreler içinde vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir assay kullanarak mRNA çeviri Yönetmeliği çalışmak için bir protokol sunuyoruz. Tahlil, 5 ‘-untranslated bölgesi (UTR) ve 3 ‘-UTR dahil olmak üzere bir mRNA BDTelemanları tarafından çeviri Yönetmeliği eğitim için kullanılabilir. Bu yöntem kullanılarak farklı çeviri başlatma modları da incelenebilir.
Abstract
Viral DNA replikasyonu sonrasında yapılan her poksvirüs mRNA, 5 ‘-UTR ‘ a evrimsel olarak koruma altına alınan, templated olmayan 5 ‘-Poly (A) lideridir. Poksvirüs enfeksiyonu sırasında mRNA tercüme 5 ‘-Poly (A) lideri rolünü incelemek için biz bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil geliştirdi. Bu muhabir tahlil dört temel adımlardan oluşur: (1) PCR in vitro transkripsiyon için DNA şablonunu yükseltmek için; (2) T7 RNA polimeraz kullanarak mRNA oluşturmak için in vitro transkripsiyon; (3) hücrelerde in vitro transkripsiyonu mRNA ‘yı tanıtmak için transfeksiyon; (4) tercüme göstergesi olarak Lusiferaz aktivitesinin tespiti. RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil burada açıklanan poxvirus enfekte hücreler ve plazmid gelen şifreli transkripsiyon plazmid çoğaltma sorunları circumvents. Bu protokol, poxvirus enfekte hücreler dışındaki sistemlerde 5 ‘-UTR ve 3 ‘-UTR dahil olmak üzere bir mRNA BDTelemanları tarafından çeviri düzenleme belirlemek için kullanılabilir. Dahası, bu yöntem kullanılarak Cap-bağımlı, Cap-bağımsız, yeniden başlatma ve iç başlatma gibi farklı çeviri başlatma modları incelenebilir.
Introduction
Orta dogma ‘ya göre, genetik bilgiler DNA ‘dan RNA ‘ya ve sonunda protein1,2‘ ye akar. Genetik bilgi bu akışı yüksek mRNA çeviri3,4dahil olmak üzere birçok düzeyde düzenlenir. Bu süreçte yer alan düzenleyici mekanizmaların anlaşılması, Gen ifadesinin düzenlenmesini ölçmek için gazetecinin geliştirilmesi konusunda yardımcı olmaktadır. Burada poxvirus enfekte hücrelerde bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil kullanarak mRNA çeviri çalışması için bir protokol açıklanmaktadır.
Poxvirüsler birçok son derece tehlikeli insan ve hayvan patojenleri5oluşturur. Diğer tüm virüsler gibi, poxvirüsler sadece protein sentezi6,7,8için ana hücre makineleri güveniyor. Verimli viral proteinleri sentezlemek için, virüsler viral mrnas7,8çevirisi için yönlendirmek için hücresel translasyonel makine kaçırmak için birçok stratejiler gelişti. Virüsler tarafından yaygın olarak kullanılan bir mekanizma, kendi transkriptlerinde BDTetkili unsurları kullanmaktır. Önemli örnekler iç ribosome giriş sitesi (IRES) ve Cap-bağımsız çeviri artırıcı (CITE)9,10,11içerir. Bu BDTelemanları, çeşitli mekanizmalar aracılığıyla translasyonel makineleri alarak viral transkriptler bir translasyonel avantajı render12,13,14. 100 Over poksvirüs mrnas ‘ın 5 ‘-untranslated bölgesi (5 ‘-UTR) içinde evrimsel olarak koruma altında olan bir eleman var: Bu mrnas15,16‘ nın çok 5 ‘ ucunda 5 ‘-Poly (a) lideri. Bu 5 ‘ Poly (A) liderlerin uzunlukları heterojen ve Transkripsiyon sırasında poxvirus kodlu RNA polimeraz kayma tarafından üretilir17,18. Biz, ve diğerleri, son zamanlarda keşfetti 5 ‘-Poly (A) lideri Vaccinia virüs ile enfekte hücrelerde bir mRNA bir çeviri avantajı confers (vacv), poxvirüsler Prototipik üyesi19,20.
İn vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz Reporter assay başlangıçta poksvirüs enfeksiyonu sırasında mRNA çeviri 5 ‘-Poly (A) lideri rolünü anlamak için geliştirilmiştir19,21. Plazmid DNA tabanlı Lusiferaz muhabiri olarak yaygın olarak kullanılan olsa da, poxvirus enfekte hücrelerde sonuç yorumu zorlaştıracak çeşitli dezavantajları vardır. İlk olarak, plazmids VACV enfekte hücrelerde çoğaltmak edebiliyoruz22. İkinci olarak, kriptik transkripsiyon genellikle Plasmid DNA18,23,24oluşur. Üçüncü olarak, VACV Promoter güdümlü transkripsiyon Poly (A) oluşturur-heterojen uzunlukları lideri sonuç olarak Poly (A)-bazı deneyler18lider uzunluğu kontrol etmek zor hale. Bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil bu sorunları circumvents ve veri yorumu basittir.
Bu yöntemde dört önemli adım vardır: (1) polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) in vitro transkripsiyon için DNA şablonunu oluşturmak için; (2) içinde vitro transkripsiyon mRNA oluşturmak için; (3) mRNA ‘yı hücrelere teslim etmek için transfeksiyon; ve (4) tercüme göstergesi olarak Lusiferaz aktivitesinin tespiti (Şekil 1). Elde edilen PCR amplikon, 5 ‘-3 ‘ yönünde aşağıdaki unsurları içerir: T7-Promoter, Poly (a) lideri veya istenen 5 ‘-UTR dizisi, Firefly Lusiferaz açık okuma çerçevesi (ORF) ve ardından Poly (a) kuyruk. PCR amplikon, T7 polimeraz kullanarak mRNA ‘yı in vitro transkripsiyon ile sentezlemek için şablon olarak kullanılır. İn vitro Transkripsiyon sırasında, m7G CAP veya diğer kapak analog yeni sentezlenmiş mRNA eklenmiştir. Capped transkriptler enfekte olmayan veya vacv enfekte hücrelere transfekte vardır. Hücre lysate transfeksiyon mRNA protein üretimini gösteren Lusiferaz faaliyetleri ölçmek için nakli sonra istenilen zamanda toplanır. Bu muhabir assay 5 ‘-UTR, 3 ‘-UTR veya bir mRNA diğer bölgelerinde BDTelemanı mevcut tarafından çeviri Yönetmeliği çalışmak için kullanılabilir. Ayrıca, in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı tahlil Cap-bağımlı başlatma, Cap-bağımsız başlatma, yeniden başlatma ve InAs gibi iç inisiyasyon dahil olmak üzere çeviri başlatma farklı mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm dört çekirdekli adımlar in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil başarısı için önemlidir. Özellikle T7 Organizatör dizisi için primer tasarıma özel dikkat verilmelidir. T7 RNA polimeraz, 5 ‘-UTR dizisinden önce eklenen T7 promotör ‘de ilk altı çizili G (ggg-5′-UTR-Aug-) den transkripsiyon başlar. Transkripsiyon başlangıç sitesi (TSS) 5 ‘ ucunda ilk g ‘den başlaysa da, T7 Organizatör bölgesinde 3 ‘ ten az olan g sayısının azaltılması RNA verim/çıkışını i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Proje, Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI128406 www.nih.gov) tarafından ZY ‘ye ve kısmen Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) tarafından PD ‘ye Lisansüstü öğrenci yaz maaşları şeklinde finanse edildi.
Materials
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In-Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. . Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
