ב מחוץ לחוק העתק RNA-מבוססי לוציפראז העיתונאי שיטת המחקר בקרת תרגום ב Poxvirus-תאים נגועים
Summary
אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את התקנת תרגום mRNA ב-poxvirus תאים נגועים באמצעות מבחנה מבוסס RNA המבוסס לוציפראז כתבת הכתב. ניתן להשתמש באותו שיטת לימוד בקרת תרגום על ידי cis-אלמנטס של mrna, כולל 5 ‘-אזור בלתי מתורגם (utr) ו-3 ‘-utr. ניתן גם לבדוק מצבי שונה של ייזום תרגום באמצעות שיטה זו.
Abstract
כל poxvirus משוכפל לאחר שכפול ה-DNA נגיפי יש שימור אבולוציונית, לא בתבניות 5 ‘-פולי (A) מנהיג 5 ‘-UTR. כדי לנתח את התפקיד של 5 ‘-פולי (A) מנהיג ב-mrna תרגום במהלך זיהום poxvirus פיתחנו בתוך מתורבת מבוסס RNA הכתב ללוציפראז הכתבת. כתבת זו מהווה כוללת של ארבעה צעדי ליבה: (1) ה-PCR כדי להגביר את תבנית הדנ א לתמלול של מבחנה; (2) בתמלול מבחנה כדי ליצור mRNA באמצעות T7 RNA פולימראז; (3) העברה בכדי להחדיר מחוץ לגופית mRNA לתוך תאים; (4) זיהוי של פעילות לוציפראז כאינדיקטור לתרגום. ה-RNA המבוסס על כתבת לוציפראז המתוארת תיאר כאן בעיות של שכפול פלשבאמצע בתאים נגועים poxvirus ושעתוק מסתורית מן הפלביניים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע את רגולציה של התרגום על ידי cis-אלמנטס ב-mrna כולל 5 ‘-utr ו-3 ‘-utr במערכות שאינן תאים נגועים poxvirus. יתר על כן, מצבים שונים של חניכה התרגום כמו כובע תלוי, כובע עצמאי, חניכה מחדש, וחניכה פנימית ניתן לחקור באמצעות שיטה זו.
Introduction
על פי הדוגמה המרכזית, מידע גנטי זורם מ-DNA ל-RNA ולבסוף חלבון1,2. זרם זה של מידע גנטי מוסדר מאוד ברמות רבות כולל התרגום mrna3,4. פיתוח הכתב הקובע למדידת ביטוי הגנים יקל על ההבנה של מנגנוני הרגולציה המעורבים בתהליך זה. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללמוד תרגום mrna באמצעות מחוץ לבית מתורבת מבוסס RNA כתבת ללוציפראז הכתבת בתאים הנגועים poxvirus.
Poxviruses מהווים רבים מאוד מסוכן אדם ופתוגנים בעלי חיים5. כמו כל הווירוסים האחרים, poxviruses להסתמך בלעדית על מכונות תא מארח עבור סינתזה חלבון6,7,8. כדי לסנתז ביעילות חלבונים ויראליים, וירוסים התפתחו אסטרטגיות רבות כדי לחטוף מכונות translational סלולרית כדי לנתב אותו לתרגום mrnas ויראלי7,8. מנגנון אחד המועסקים בדרך כלל על ידי וירוסים הוא להשתמש באלמנטים cis-משחק התעתיקים שלהם. הדוגמאות הבולטות כוללות את האתר הפנימי ריבוכמה כניסה (IRES) ומשפר תרגום עצמאית כובע (לצטט)9,10,11. אלה רכיבי ציסלהפוך את התעתיקים הנגיפי יתרון טרנסלtional על ידי משיכת מכונות translational באמצעות מנגנונים שונים12,13,14. מעל 100 poxvirus mrnas יש מרכיב שמור לגמרי cis-משחק באזור 5 ‘-untranslated (5 ‘-utr): 5 ‘-פולי (א) מנהיג ב 5 ‘ הקצוות של אלה mrnas15,16. האורכים של אלה 5 ‘-פולי (א) מנהיגים הם הטרוגנית ומופקים על ידי החלקה של רנ א poxvirus מקודד RNA פולימראז במהלך שעתוק17,18. אנחנו, ואחרים, לאחרונה גילו כי 5 ‘-פולי (A) מנהיג לקיים יתרון תרגום ל mrna בתאים נגוע vaccinia וירוס (vacv), חבר פרוטוטיפקס של poxviruses19,20.
בשנת מחוץ לחוק העתק RNA המבוסס הכתב ללוציפראז פותחה בתחילה כדי להבין את התפקיד של 5 ‘-פולי (א) מנהיג ב-mrna תרגום במהלך זיהום poxvirus19,21. למרות בסיס DNA המבוסס העיתונאי ללוציפראז שימוש נרחב, ישנם החסרונות מספר כי יהיה לסבך את פרשנות התוצאה בתאים נגועים poxvirus. ראשון, פלמידים מסוגלים לשכפל בתאים נגועים VACV22. שנית, שעתוק מוזר מתרחש לעתים קרובות בשנת DNA מפלסטיק18,23,24. שלישית, שעתוק מונחה המקדם של VACV מייצר פולי (א)-מנהיג האורכים הטרוגנית ובכך קשה לשלוט באורך המוביל של המנהיג בכמה ניסויים18. A ב מתורבת מבוסס RNA המבוסס העיתונאי ללוציפראז בעיות אלה ופרשנות הנתונים הוא פשוט.
ישנם ארבעה שלבים מרכזיים בשיטה זו: (1) התגובה שרשרת פולימראז (PCR) כדי ליצור את תבנית ה-DNA עבור תמלול של מבחנה; (2) בתמלול מתורבת להפקת mRNA; (3) העברה כדי לספק mRNA לתוך תאים; ו (4) זיהוי של פעילות לוציפראז כאינדיקטור לתרגום (איור 1). ה-PCR אמפליקון מכיל את האלמנטים הבאים ב 5 ‘ עד 3 כיוון: T7-יזם, פולי (A) מנהיג או המבוקש 5 ‘-utr רצף, גחלילית ללוציפראז פתח מסגרת קריאה (orf) ואחריו הזנב פולי (A). ה-PCR אמפליקון משמש כתבנית לסנתז mrna על ידי תמלול מחוץ לחומרים באמצעות T7 פולימראז. במהלך שעתוק מחוץ לחומרים מסוימים, כובע מז7גרם או כובע אנלוגי אחר משולב ב-mrna החדש מסונתז. התעתיקים הוכתרים מתגברים לתוך. תאים נגועים או מזוהמים בשואב אבק ליפוסט התא נאסף בזמן הרצוי לאחר החצייה כדי למדוד פעילויות לוציפראז המציינות ייצור חלבון מ mRNA מזוהמים. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי ללמוד את התקנת התרגום של הרכיב cis-הנוכחי ב-5 ‘-utr, 3 ‘-utr או אזורים אחרים של mrna. יתר על כן, מחוץ למבחנה מבוססת RNA מבוססי שימוש ניתן להשתמש כדי ללמוד מנגנונים שונים של ייזום התרגום כולל חניכה תלוי כובע, חניכה כובע עצמאי, ייזום מחדש וחניכה פנימית כמו IRES.
Protocol
Representative Results
Discussion
כל השלבים ארבע-ליבות הם קריטיים להצלחת המועתק מחוץ לחוק רנ א מבוסס RNA הכתב ללוציפראז. תשומת לב מיוחדת ניתנת לעיצוב פריימר, במיוחד עבור רצף היזם T7. T7 RNA פולימראז מתחיל תעתיק מן הראשון המסומן G (gGG-5′-UTR-AUG-) ב T7 יזם הוסיף לפני רצף 5 ‘-utr. למרות באתר להתחיל שעתוק (TSS) מתחיל מ-G הראשון בסוף 5 ‘, להקטין את…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות (AI128406 www.nih.gov) ל ZY ו בחלק על ידי מרכז המחקר של סרטן ג’ונסון (http://cancer.k-state.edu) בצורה של הסטודנט לתואר ראשון בקיץ לPD.
Materials
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In-Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. . Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
