في المختبر المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي القائم علي الفحص التشخيصي لدراسة تنظيم الترجمة في الخلايا المصابة Poxvirus
Summary
نحن نقدم بروتوكولا لدراسة قواعد الترجمة mRNA في الخلايا المصابة بفيروس الإيدز باستخدام في المختبر المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي القائم علي فحص المخبر. ويمكن استخدام الفحص لدراسة تنظيم الترجمة من قبل رابطه الدولالمستقلة-عناصر من mrna ، بما في ذلك 5 ‘-المنطقة غير المترجمة (utr) و 3 ‘-utr. يمكن أيضا فحص أوضاع بدء الترجمة المختلفة باستخدام هذه الطريقة.
Abstract
كل mrna الفيروسه الجدريه المنسوخة بعد الفيروسية الحمض النووي النسخ المتماثل لديه المحافظة علي التطور ، غير–templated 5 ‘–بولي (A) زعيم في 5 ‘-utr. لتشريح دور 5 ‘-بولي (A) الرائدة في الترجمة mrna اثناء العدوى الفيروسه الجدريه وضعنا في المختبر المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي علي أساس الفحص الصحفي لوسيفيراز. هذا الفحص الصحفي يتكون من أربع خطوات أساسيه: (1) PCR لتضخيم قالب الحمض النووي للنسخ في المختبر. (2) في النسخ الأنبوبي لتوليد mRNA باستخدام T7 الجيش النيبالي الريبي البوليميريز; (3) الانتقال إلى إدخال في المختبر كتبت mRNA في الخلايا ؛ (4) الكشف عن نشاط لوسيفيراز كمؤشر للترجمة. فحص المخبر لوسيفيراز المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي وصفت هنا القضايا من النسخ المتماثل البلازميد في الخلايا المصابة poxvirus والنسخ خفي من البلازميد. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد تنظيم الترجمة من قبل عناصر رابطه الدولالمستقلة في mrna بما في ذلك 5 ‘-utr و 3 ‘-utr في أنظمه أخرى غير الخلايا المصابة بفيروسات. وعلاوة علي ذلك ، يمكن التحقيق في طرق مختلفه لبدء الترجمة مثل الاعتماد علي الغطاء ، والغطاء المستقل ، وأعاده البدء ، والبدء الداخلي باستخدام هذه الطريقة.
Introduction
وفقا ل العقيدة مركزيه, يتدفق معلومة وراثيه من [دنا] إلى [رنا] وبعد ذلك أخيرا إلى بروتين1,2. وينظم هذا التدفق من المعلومات الوراثية للغاية علي العديد من المستويات بما في ذلك mrna الترجمة3,4. ومن شان تطوير اختبارات المراسلين لقياس تنظيم التعبير الجيني ان ييسر فهم أليات التنظيمية المعنية بهذه العملية. هنا نحن وصف بروتوكول لدراسة mrna الترجمة باستخدام في المختبر المستندة إلى الجيش الريبي النيبالي القائم علي فحص المخبر لوسيفيراز في الخلايا المصابة poxvirus.
وتشمل الفيروسات العديد من مسببات الامراض البشرية والحيوانية خطيره جدا5. مثل جميع الفيروسات الأخرى ، poxvirusesات تعتمد حصرا علي آلات الخلية المضيفة لتخليق البروتين6،7،8. لتوليف بكفاءة البروتينات الفيروسية ، تطورت الفيروسات العديد من الاستراتيجيات لخطف آلات الخلوية الانتقالية لأعاده توجيهها لترجمه mrnas الفيروسية7،8. وتتمثل أحدي أليات الشائعة الاستخدام بواسطة الفيروسات في استعمال عناصر رابطه الدولالمستقلة في محاضرها. ومن الامثله البارزة علي ذلك الموقع الداخلي للدخول إلى الريبوسوم (المعهد الوطني للترجمة) ومحسن الترجمة المستقلة بالكاب (سايت)9و10و11. هذه العناصر cisجعل المستنسخات الفيروسية ميزه متعديه من خلال جذب آلات متعديه عبر أليات متنوعة12,13,14. أكثر من 100 الفيروسه الجدريه mrnas لديها تطور العنصر cis-بالوكالة بالانابه في 5 ‘-المنطقة غير المترجمة (5 ‘-utr): 5 ‘-بولي (a) زعيم في غاية 5 ‘ نهايات من هذه mrnas15,16. أطوال هذه 5 ‘-بولي (ا) القادة غير المتجانسة والتي تولدها الانزلاق من الحمض الريبي النيبالية المشفرة poxvirus خلال النسخ17,18. ونحن ، وغيرها ، اكتشفت مؤخرا ان الزعيم 5 ‘-بولي (A) يمنح ميزه الترجمة إلى mrna في الخلايا المصابة بفيروس فاكينيا (vacv) ، عضو تراجعي من poxviruses19،20.
في المختبر وقد تم تطويره في البداية لفهم دور 5 ‘-بولي (A) الرائدة في الترجمة في mrna التي كتبها الحمض الريبي النيبالي-المستندة إلى المخبر المخبري الفحص خلال العدوى الفيروسه الجدريه19,21. علي الرغم من ان التحاليل المستندة إلى الحمض النووي plasferase علي أساس الدنا وقد استخدمت علي نطاق واسع ، وهناك العديد من العيوب التي من شانها ان تعقد تفسير النتيجة في الخلايا المصابة poxvirus. أولا ، البلازميدات قادره علي تكرار في الخلايا المصابة VACV22. الثانية ، وغالبا ما يحدث النسخ خفي من البلازميد الحمض النووي18،23،24. الثالثة ، VACV المروج يحركها النسخ يولد بولي (A)-زعيم أطوال غير متجانسة مما يجعل من الصعب السيطرة علي بولي (A)-طول الزعيم في بعض التجارب18. في المختبر التي كتبها الجيش الريبي النيبالي القائم علي الفحص الصحفي لوسيفيراز بالتفاف هذه القضايا وتفسير البيانات واضحة.
هناك أربع خطوات رئيسيه في هذا الأسلوب: (1) تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) لتوليد قالب الحمض النووي للنسخ في المختبر. (2) في النسخ الأنبوبي لتوليد mRNA ؛ (3) النقل العابر لتسليم mRNA إلى الخلايا ؛ و (4) الكشف عن نشاط لوسيفيراز كمؤشر للترجمة (الشكل 1). الناتج PCR الفتحة يحتوي علي العناصر التالية في 5 ‘ إلى 3 ‘ الاتجاه: T7 المروج ، بولي (A) زعيم أو المطلوب 5 ‘-utr تسلسل ، اليراع لوسيفيراز فتح اطار القراءة (ORF) متبوعا بولي (a) الذيل. يستخدم PCR الاتساع كقالب لتوليف mRNA من خلال النسخ في المختبر باستخدام T7 البوليميرات. خلال النسخ في المختبر ، يتم تضمين m7G كاب أو غيرها من التناظرية غطاء في mrna توليفها حديثا. يتم نقل النصوص التي تمت تغطيتها إلى خلايا غير مصابه أو خاليه من العدوى. يتم جمع الخلية محلله في الوقت المطلوب بعد التحويل لقياس الانشطه لوسيفيراز التي تشير إلى إنتاج البروتين من mrna المحولة. ويمكن استخدام هذا الفحص الصحفي لدراسة تنظيم الترجمة من قبل رابطه الدولالمستقلة-عنصر الحاضر في 5 ‘-utr ، 3 ‘-utr أو مناطق أخرى من mrna. وعلاوة علي ذلك ، فان الفحص المستند إلى الحمض الريبي في المختبر يمكن استخدامه لدراسة أليات مختلفه لبدء الترجمة بما في ذلك البدء المعتمد علي الغطاء ، والبدء المستقل ، وأعاده البدء ، والبدء الداخلي مثل المعهد الوطني للدراسات.
Protocol
Representative Results
Discussion
جميع الخطوات الاربعه الاساسيه هي حاسمه لنجاح في المختبر المستندة إلى الحمض الريبي النيبالي القائم علي الفحص الصحفي لوسيفيراز. وينبغي إيلاء اهتمام خاص لتصميم التمهيدي ، وخاصه بالنسبة للتسلسل المروج T7. T7 [رنا] [بولمرس] يبدا نسخ من ال يؤكد اولي [غ] ([غ] [ز-5 ‘-UTR-أب-]) في T7 مروج يضيف قبل ال [5 ‘-utr] ت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة (AI128406 www.nih.gov) إلى ZY وجزئيا من قبل مركز جونسون لأبحاث السرطان (http://cancer.k-state.edu) في شكل راتب الصيف طالب الدراسات العليا إلى PD.
Materials
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In-Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. . Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
