В пробирке Транскрибированная РНК-основанная Люцифаза репортер анализ для изучения перевода регулирование в poxvirus-инфицированных клеток
Summary
Мы представляем протокол для изучения регулирования перевода мРНК в poxvirus-инфицированных клетках с использованием в пробирке Транскрибированного РНК-на основе анализа репортер люциферазы. Анализ может быть использован для изучения правил перевода СНГ-элементами мРНК, в том числе 5 ‘-непереведенного региона (UTR) и 3 ‘-UTR. С помощью этого метода можно также изучить различные режимы инициирования перевода.
Abstract
Каждый poxvirus мРНК транскрибируется после вирусной репликации ДНК имеет эволюционно сохраняется, не-шаблонированные 5 ‘-поли (а) лидер в 5 ‘-UTR. Для того, чтобы вскрыть роль 5 ‘-поли (A) лидер в переводе мРНК во время poxvirus инфекции мы разработали в пробирке транскрипции РНК-на основе анализа репортер люциферазы. Этот репортер анализ состоит из четырех основных этапов: (1) ЦР, чтобы усилить шаблон ДНК для экстракорпорального транскрипции; (2) в пробирке транскрипции для генерации мРНК с использованием T7 РНК-полимеразы; (3) трансфеекция ввести в пробирке транскрибированной мРНК в клетки; (4) обнаружение активности люциферазы как индикатора перевода. РНК-основанная люцифазы репортер анализ описал здесь обходит вопросы плазмированной репликации в poxvirus-инфицированных клеток и загадочные транскрипции из плазмида. Этот протокол может быть использован для определения правил перевода СНГ-элементов в мРНК, включая 5 ‘-UTR и 3 ‘-UTR в системах, не инфицированных poxvirus. Кроме того, с помощью этого метода можно исследовать различные режимы инициирования перевода, такие как ограничения, зависящие от капитализации, повторное посвящение и внутреннее инициирование.
Introduction
Согласно Центральной догме, генетическая информация течет от ДНК к РНК, а затем, наконец, к белку1,2. Этот поток генетической информации жестко регулируется на многих уровнях, включая мРНК перевод3,4. Разработка журналистскими проверочные исследования для измерения регулирования экспрессии генов облегчит понимание регуляторных механизмов, участвующих в этом процессе. Здесь мы описываем протокол для изучения перевода мРНК с помощью экстракорпорального транскрибированного РНК-анализа на основе вируса люциферазы в poxvirus-инфицированных клетках.
Poxviruses состоят из многих очень опасных патогенов человека и животных5. Как и все другие вирусы, поксвирусов полагаются на оборудование клеток-хозяев для синтеза белка6,7,8. Для эффективного синтеза вирусных белков, вирусы развивались многие стратегии, чтобы захватить сотовой трансляционной машины, чтобы перенаправить его для перевода вирусного mRNAs7,8. Одним из распространенных механизмов, используемых вирусами, является использование в их транскриптах элементов, действующих в СНГ. Известные примеры включают в себя внутренний вход ribosome (IRES) и Кап-независимый перевод усилитель (цитируют)9,10,11. Эти СНГ-элементы оказывают вирусную стенограммы поступательное преимущество путем привлечения поступательного машинного оборудования через различные механизмы12,13,14. Более 100 poxvirus mRNAs имеют эволюционно консервативны цис-действующий элемент в 5 ‘-непереведенный регион (5 ‘-UTR): 5 ‘-поли (а) лидер в самом 5 ‘ концы этих mRNAs15,16. Длины этих 5 ‘-поли (а) лидеры гетерогенных и генерируются проскальзывание poxvirus кодируется РНК полимеразы во время транскрипции17,18. Мы и другие, недавно обнаружили, что 5 ‘-поли (а) лидер дает перевод преимущество мРНК в клетках, инфицированных вирусом вакцинии (ВАВ), прототипический член поксвирусов19,20.
В пробирке транскрибированный РНК-основанный люциффераз репортер анализ был первоначально разработан, чтобы понять роль 5 ‘-поли) лидер в мРНК перевода во время poxvirus инфекция19,21. Хотя плазмино ДНК-основанные люциферазы репортер анализы широко используются, есть несколько недостатков, которые усложнят интерпретации результатов в poxvirus-инфицированных клеток. Во-первых, плазмид способны реплицировать в ВАV-инфицированных клетках22. Во-вторых, загадочные транскрипции часто происходит от плазмид ДНК18,23,24. В-третьих, ВАВ промоутер управляемой транскрипции генерирует поли (а)-лидер гетерогенной длины, следовательно, делает его трудно контролировать поли (а)-лидер длины в некоторых экспериментах18. В пробирке транскрибированный на основе РНК-люциффераза репортер анализ обходит эти вопросы и интерпретации данных проста.
Есть четыре ключевых шага в этом методе: (1) полимеразной цепной реакции (ЦР) для генерации шаблона ДНК для экстракорпорального транскрипции; (2) в пробирке транскрипции для генерации мРНК; (3) трансфеекция для доставки мРНК в клетки; и (4) обнаружение деятельности люциферазы в качестве показателя перевода (рис. 1). В результате КЦР ампликон содержит следующие элементы в 5 ‘ к 3 ‘ направление: T7-промоутер, поли (а) лидер или желаемого 5 ‘-UTR последовательности, Открытый люциферазы чтения кадр (ОРФ), а затем поли (а) хвост. КЦР ампликон используется в качестве шаблона для синтеза мРНК в пробирке транскрипции с использованием T7 полимеразы. Во время в пробирке транскрипции, m7G Cap или другой аналоговый колпачок включен в недавно синтезированных мРНК. Увенчанные стенограммы трансфцируются в неинфицированные или вкv-инфицированные клетки. Клетка lyнасыт собирается в нужное время после переливания для измерения деятельности люциферазы, которые указывают на выработку белка с трансффицированных мРНК. Этот репортер анализ может быть использован для изучения перевода регулирование СНГ-элемент присутствует в 5 ‘-UTR, 3 ‘-UTR или других регионах мРНК. Кроме того, в пробирке транскрибированной РНК-анализ может быть использован для изучения различных механизмов начала перевода в том числе крышки-зависимого инициирования, крышка независимого инициирования, повторного посвящения и внутреннего начала, как IRES.
Protocol
Representative Results
Discussion
Все четыре основные шаги имеют решающее значение для успеха в пробирке транскрибированной РНК-на основе анализа репортер люциферазы. Особое внимание следует уделять дизайну грунтовки, особенно для последовательности промоутера T7. T7 РНК-полимеразы начинается транскрипция с подчеркну…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Проект финансировался национальными институтами здоровья (AI128406 www.nih.gov) в ZY и частично Джонсон онкологический исследовательский центр (http://cancer.k-state.edu) в форме аспирант летняя Стипендия для PD.
Materials
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In-Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. . Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
