Stimululated Raman saçılma dayalı doğrusal olmayan mikroskop uygulanması

Yaşam bilimi uygulamalarında SRS mikroskobu, etiket içermeyen görüntüleme için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. SRS mikroskobu temel fikri vibrasyonel kontrast gücünü ve birkaç saniye içinde görüntü edinme yeteneğini birleştirmek için.

SRS, iki lazer ışınları frekansları arasındaki frekans farkının (farklı frekanslarda pompa sinyali ve Stokes sinyali) incelendiği bir numunenin moleküler titreşimi ile eşleştiğini, uyarılmış Raman saçılma ve önemli bir Stokes sinyalinde artış. Doğrusal Raman spektroskopisinin aksine SRS, gelen ışık alanlarına doğrusal olmayan bir bağımlılığı sergiler ve tutarlı radyasyon üretir. SRS ‘nin iki temel avantajı vardır: 1) hız, hangi görüntüleri örnek hareket veya bozulma kaynaklanan eserler daha az duyarlı hale getirir, ve 2) mükemmel bir sinyal-gürültü oranı (SNR). Buna ek olarak, SRS spontan Raman ile özdeş bir spektrum sergiler ve SRS sinyal kimyasal Bond heyecanlı konsantrasyon ile doğrusal orantılı^{1,2,3,4, 5}‘ i yapın.

Mikroskobu olarak, femtosaniye (FS) SRS deneysel ayarlama, hızlı aynalar tarama ünitesi (Şekil 1)^6,7,8ile donatılmış, ters çevrilmiş bir optik mikroskop ile entegre edilmiştir. Bu mikroskop uygulamak için iki Pulse lazer kaynakları kullanılır. İlk bir FS-Ti: sa yaklaşık 140 FS nabız süresi ile, 80 MHz tekrarlama oranı ve 680-1080 nm aralığında emisyon dalga boyları. İkinci, prob ışını olarak kullanılan ve Ti: SA tarafından pompalanan, bir femtosaniye senkronize optik parametrik osilatör (Sopo), yaklaşık 200 FS nabız süresi ile, 80 MHz tekrarlama oranı, ve emisyon dalga boyları aralığında 1000-1600 Nm. Ti: SA ve SOPO ışını arasındaki asgari foton enerji farkının 2500 cm^-1olduğu unutulmamalıdır. Bu nedenle, bu kombinasyonu kullanarak lazer sistemleri, sadece yüksek frekanslı C-H Bölgesi (2800-3200 cm^-1) Raman Spectra keşfedilebilir^6,7,8.

SRS mikroskop ayarlamak için, art arda paragraflarda açıklanan dikkate alınması gereken üç önemli sorunlar vardır. İlk yüksek frekanslı modülasyon transfer yönteminin uygulamasıdır (bkz. Şekil 2 ve adım 2,1 bir açıklama için protokol). SRS deneysel soruşturmada, önemli bir parametre sistemin hassasiyetidir. SRS sinyali, uyarma kirişlerinin yoğunluğunda küçük bir değişiklik olarak algılanır; Bu nedenle, lazer yoğunluğu gürültü ve atış gürültüsü ile bozulabilir. Bu sorun, bu sistemi yüksek frekanslı modülasyon aktarım yöntemiyle bütünleştirerek üstesinden gelebilir (bkz. Şekil 2 ve adım 2,1 Ayrıntılar için protokol). Bu yöntemle pompa modülatmek için bir elektro-optik Modulatör (EOM) kullanılır. Prob ışınına aktarılan modülasyon daha sonra bir PD tarafından optik filtreler yığını ile pompa ışını bloke sonra tespit edilebilir [Raman kazanç uyarılmış (SRG) algılama modu]. PD çıkışı, ölçülen sinyali demodüle eden bir kilit amplifikatörüne (LıA) düşük geçiş filtresine bağlanır. Işın modülasyon sıklığını 1 MHz ‘in üzerindeki frekanslara artırarak, PDs ‘nin içsel sınırı elde edilebilir.

İkinci konu göz önünde bulundurulması gereken ileri algılama yürütmek ve aynı zamanda Brightfield mikroskop gözlem korumak için izin mekanik bir montaj kurulumu. Ayrıca, görüntü üretimi sırasında mekanik titreşim nedeniyle gürültüyü azaltmak ve algılama sisteminin kesin yeniden konumlandırılmasına izin vermek gerekir (bkz. Şekil 3 ve protokol 2,2 adım).

Üçüncüsü, faz duyarlı algılama şeması tarafından alınan sinyalin senkronizasyon, mikroskobun tarama kafası tarafından izlenen örnek üzerine konumlandırılmış kiriş ile. Görüntüleri gerçekleştirmek için, SMs tarama kafası birimine bağlı mikroskop denetleyici tarafından kullanılabilir hale gelen üç TTL sinyalleri gerektirir: piksel saat, hat senkronizasyonu, ve çerçeve senkronizasyonu. Senkronizasyon, bir PCI kartı, üç TTL sinyalleri ve LIA^6,7,8çıkış kanalında bir voltaj sinyalinin alınması kullanılarak kontrol edilerek elde edilir. Ev yapımı bir yazılım geliştirilmiş ve önceden açıklanan^6,7,⁸, senkronizasyon sisteminin donanımı Şekil 4‘ te rapor edilirken.

SRS görüntüleme yapılırken temel bir prosedür mikroskop hizalaması. Bu, ardışık paragraflarda açıklanan dört adım boyunca gerçekleştirilir. İlk iki kiriş uzamsal çakışıyor (protokol adım 3,1 bakın). Bu deneysel ayarda, iki kiriş, dikrotik bir ayna ile birlikte dağınık bir şekilde birleşmiştir. Ön adım OPO ve TI: sa hizalaması, böylece her mikroskop ulaşır. Daha sonra, bir referans ışını olarak OPO göz önüne alındığında ve bir pozisyon duyarlı Dedektör yararlanarak, TI: sa dağınık OPO için örtüşmesi.

İkinci önemli yönü iki kiriş temporal çakışıyor (protokol adım 3,2 bakın). Onlar OPO konut içinde biraz farklı kiriş yolları takip beri pompa ve OPO kirişler mükemmel senkronize⁹, onlar yaklaşık 5 NS ve 5 cm uzamsal fark bir zaman GECIKMESI var OPO çıkışında bile. Bu nedenle, TI: SA ve OPO örnekteki geçici çakışmayı sağlamak için optik yeniden zamanlanmış gerektirir. Bu genellikle, bu durumda Ti: SA ve mikroskop arasında eklenen ince ayarlanabilir optik gecikme hattı ile gerçekleştirilir (bkz. Şekil 1). İki kiriş temporal çakışmayı elde etmek için iki teknik kullanılır. İlki hızlı PD ve osiloskop kullanılarak gerçekleştirilir, ikincisi ise otomatik ve çapraz optik korelasyonlar üzerine kuruludur. İlk tekniği kullanarak, iki kiriş kaba bir çakışma elde edilir (belirsizlik 10 PS), iki kiriş doğru temporal örtüşme bir çapraz-korrelatör (1 FS çözünürlüğü) kullanılarak elde edilir iken.

Üçüncü önemli yönü mikroskop içinde iki kiriş hizalama (protokol 3,3 adım bakın). Örnek bir ön beyaz ışık gözlem istenen görüş alanı (FOV) bireyye sağlar. Daha sonra, mikroskopla bir yan liman tarafından mikroskop giren lazer kirişler, üst parçaya monte edilen PD ‘ye ulaşmak için hizalanır (Şekil 3). Ancak, doğru görüntü edinme için, bir dizi parametreyi ayarlamak gereklidir (örneğin, piksel boyutu ve piksel bekleme süresi). Örnekleme sıklığı, bir görüntüdeki tüm bilgileri korumak için Nyquist ‘in teoremi tarafından uygulanan kısıtlamaya saygı göstermelidir, ancak her pikselde ölçülen uzamsal koordinatlar ve SRS değerinin arasında doğru bir yazışmalar için, entegrasyon süresi eşit veya piksel bekleme süresi ile karşılaştırılabilir olmalıdır.

Mikroskop hizalama son adımda, çok sayıda testler uzamsal ve temporal hizalama optimize etmek için gerçekleştirilir (protokol adım 3,4 bakın). Bir dizi iletim görüntüleri (TI) her ikisi için Ti: SA ve OPO uzamsal çakışmayı en iyi duruma getirmek için elde edilir. Bir TI ‘de, tek bir kiriş kullanılır ve örnekteki iletilen ışın yoğunluğu bir PD ile ölçülür. TI ise OPO tarafından gerçekleştirilen durumda, PD çıkış sinyali doğrudan PCI kartına bağlanır, TI durumunda Ti: SA tarafından gerçekleştirilen durumunda, PD çıkış sinyali LIA bağlı ve LıA analog çıkış PCI kartına bağlanır. İletim görüntüleri FOV optimize etmek için çok yararlıdır, aydınlatma, mikroskop hedefleri odak pozisyonu ve iki kiriş dağınık^6,7,8olup olmadığını kontrol etmek.

Pompa ve prob ışınının temporal çakışmanın optimizasyonu, 3,3 FS zaman vardiyasına karşılık gelen 0,001 mm ‘lik adımlarla gecikme çizgisini tarayarak ve çapı 3 μm olan polistiren boncuk numunesi tek bir noktada SRS ölçümü gerçekleştirerek elde edilir. Bir SRS sinyalinin amplitüdü, prob pompası gecikmesinin bir işlevi olarak, LIA ‘dan değerleri ölçer ve iki kiriş^6,7,8ile tam temporal örtüşme ile karşılık gelen maksimum sağlar. Sonuçlandırmadan önce, tüm tartışılan adımlar yüksek kaliteli bir görüntü elde etmek için zorunlu olduğunu unutulmamalıdır.