Реализация нелинейного микроскопа на основе стимулируемого рассеяния Рамана

В приложениях науки о жизни микроскопия SRS стала мощным инструментом для визуализации без этикеток. Основная идея микроскопии SRS заключается в том, чтобы объединить силу колебательных контрастов и его способность приобретать изображения в течение нескольких секунд.

SRS это процесс, в котором разница в частотах между двумя частотами лазерных лучей (сигнал насоса и топит сигнал на разных частотах) соответствует молекулярной вибрации исследуемого образца, вызывая стимулируемое рассеяние Раман и значительное увеличение сигнала Стокса. В отличие от линейной Рамане-спектроскопии, СРС обладает нелинейной зависимостью от входящих световых полей и производит когерентное излучение. SRS имеет два основных преимущества: 1) скорость, которая делает изображения менее чувствительными к артефактам, возникающим в результате движения образца или деградации, и 2) отличное соотношение сигнала к шуму (SNR). Кроме того, SRS экспонатов спектра идентичны спонтанным Раман, и сигнал SRS линейно пропорционально концентрации химической связи возбужденных^{1,2,3,4, 5}.

В нашем микроскопе, фемтосекунда (fs) SRS экспериментальная настройка интегрирована с перевернутым оптическим микроскопом оснащен быстрым зеркалом сканирующей единицы(Рисунок 1)^6,7,8. Для реализации этого микроскопа используются два импульсных лазерных источника. Первый fs-Ti:Sa с продолжительностью пульса около 140 fs, частотой повторения 80 МГц и длиной волн выбросов в диапазоне 680-1080 нм. Второй, используемый в качестве пучка зонда и накачиваемый Ti:Sa, представляет собой фемтосекундный синхронизированный оптический параметрический осциллятор (SOPO), с пульсом продолжительностью около 200 л.с., частотой повторения 80 МГц и длиной волн выбросов в диапазоне 1000-1600 нм. Следует отметить, что минимальная разница в энергии фотона между пучком Ti:Sa и SOPO составляет 2500 см^-1. Поэтому, используя эту комбинацию лазерных систем, можно исследовать только высокочастотную область C-H (2800-3200 см^-1) Раманских спектров^6,7,8.

Для создания микроскопа СРС необходимо рассмотреть три важнейших вопроса, которые описаны в последовательных пунктах. Во-первых, это внедрение высокочастотного метода передачи модуляции (см. рисунок 2 и шаг 2.1 протокола для описания). В экспериментальном исследовании SRS важнейшим параметром является чувствительность системы. Сигнал SRS обнаруживается как небольшое изменение интенсивности лучей возбуждения; таким образом, он может быть поврежден лазерным шумом интенсивности и выстрелом. Эту проблему можно решить путем интеграции этой системы с высокочастотным методом передачи модуляции (см. рисунок 2 и шаг 2.1 протокола для деталей). В этом методе используется электрооптический модулятор (EOM) для модулировать насос. Модуляция, передаваемый на пучок зонда, может быть обнаружена PD после блокирования пучка насоса стеком оптических фильтров (стимулировал обретение Рамана (SRG) режим обнаружения». Выход PD соединен фильтром низкого прохода с усилителем блокировки (LIA), который демонополирует измеренный сигнал. Увеличивая частоту модуляции луча на частоты выше 1 МГц, можно получить внутренний предел ПД.

Вторым вопросом, который необходимо рассмотреть, является установка механической крепления, которая позволяет осуществлять дальновидное обнаружение и в то же время сохранять микроскопическую наблюдение в ярком поле. Кроме того, он должен уменьшить шум из-за механической вибрации во время генерации изображений и обеспечить точное перепозиционирование системы обнаружения (см. рисунок 3 и шаг 2.2 протокола).

Третьим является синхронизация сигнала, полученного по схеме фазочувствительного обнаружения, при этом луч расположен на образце, контролируемом сканирующей головкой микроскопа. Для реализации изображений SMs требуются три сигнала TTL, которые доступны контроллером микроскопа, подключенным к головному блоку сканирования: пиксельные часы, синхронизация линии и синхронизация кадра. Синхронизация достигается путем управления с помощью карты PCI, трех сигналов TTL и приобретения сигналанапряжения на выходном канале LIA 6,^7,8. Домашнее программное обеспечение былоразработано и описано ранее 6,^7,8, в то время как оборудование системы синхронизации сообщается в рисунке 4.

Фундаментальной процедурой при проведении sRS-изображения является выравнивание микроскопа. Она реализуется в течение четырех этапов, которые описаны в последовательных пунктах. Во-первых, это пространственное перекрытие двух лучей (см. шаг 3.1 протокола). В этой экспериментальной настройки, два луча были пространственно collinearly сочетании дихроического зеркала. Предварительный шаг является выравнивание OPO и Ti:Sa так, что каждый достигает микроскопа. Затем, рассматривая OPO в качестве эталонного луча и пользуясь детектором чувствительного к позиции, Ti:Sa пространственно перекрывается с OPO.

Вторым важным аспектом является временное перекрытие двух лучей (см. шаг 3.2 протокола). Даже если пучки насоса и OPO идеально синхронизированы⁹, так как они следуют несколько иными путями пучка внутри корпуса OPO, при выходе OPO они имеют задержку во времени около 5 нс и пространственную разницу в 5 см. Поэтому Ti:Sa и OPO требуют повторного времени оптически для обеспечения временного перекрытия в выборке. Это обычно достигается с тонко настраиваемым оптической линией задержки, которая в этом случае вставляется между Ti:Sa и микроскопом (см. рисунок 1). Для получения временного перекрытия двух лучей используются два метода. Первый осуществляется с использованием быстрого PD и осциллоскопа, в то время как второй основан на авто- и кросс-оптических корреляциях. Используя первый метод, получается грубое перекрытие двух лучей (неопределенность 10 сц), в то время как точное временное перекрытие двух лучей получается с помощью кросс-коррелятора (разрешение 1 fs).

Третьим важным аспектом является выравнивание двух лучей внутри микроскопа (см. шаг 3.3 протокола). Предварительное наблюдение белого света образца позволяет индивидуовать желаемое поле зрения (FOV). После этого лазерные лучи, попадая в микроскоп по боковому порту микроскопа, выравниваются для того, чтобы достичь PD, установленного на верхней части(рисунок 3). Однако для правильного приобретения изображения требуется установка ряда параметров (например, размер пикселя и время обитать пикселей). Частота выборки должна соблюдать ограничения, наложенные теорему Нюквиста для сохранения всей информации в изображении, в то время как для правильного соответствия между пространственными координатами пикселей и значением SRS измеряется в каждом пикселе, время интеграции LIA должен быть равным или сопоставимым с пиксельным временем пребывания.

На заключительном этапе выравнивания микроскопа проводятся многочисленные тесты для оптимизации пространственного и временного выравнивания (см. шаг 3.4 протокола). Для оптимизации пространственного перекрытия приобретен ряд изображений передачи (TI) для Ti:Sa и OPO. В TI используется один луч, а интенсивность передаваемого луча из образца измеряется PD. В случае TI реализованo OPO, сигнал выхода PD непосредственно подключен к карте PCI, в то время как в случае TI реализованы Ti:Sa, pd выходной сигнал подключен к LIA и аналоговый выход LIA подключен к карте PCI. Передача изображения очень полезны для оптимизации FOV, освещение, фокусное положение целей микроскопа и проверить, если двалуча пространственно перекрываются 6,^7,8.

Оптимизация височного перекрытия насоса и пера пучка зонда осуществляется путем сканирования линии задержки с помощью ступеней 0,001 мм, соответствующих сдвигу в 3,3 fs, и проведения измерения SRS в одной точке образца полистирола 3 мкм в диаметре. Амплитуда сигнала SRS измеряет значения от LIA, как функция задержки зонд-насоса, и обеспечивает максимальное соответствие с точным временным перекрытием двух лучей^6,7,8. Прежде чем завершить, следует отметить, что все обсуждаемые шаги являются обязательными для получения высококачественного изображения.