יישום של מיקרוסקופ לא לינארית על בסיס פיזור ראמאן מגורה

ביישומי מדעי החיים, מיקרוסקופ SRS התפתחה ככלי רב עוצמה עבור דימות ללא תווית. הרעיון הבסיסי של מיקרוסקופ SRS הוא לשלב את עוצמת הניגודיות התנובותית ואת יכולתה להשיג תמונות בתוך שניות ספורות.

SRS הוא תהליך שבו הפרש התדירות בין שני תדרי קרני לייזר (אות משאבה ואות סטוקס בתדרים שונים) מתאים את הרטט המולקולרי של דגימת נחקר, וגורם מגורה פיזור ראמאן ומשמעותי עליה. באות של סטוקס בניגוד ליניארי ספקטרוסקופית ראמאן, SRS מציג תלות לא לינארית על שדות האור הנכנסות ומייצרת קרינה קוהרנטית. ל-SRS יש שני יתרונות בסיסיים: 1) מהירות, מה שהופך את התמונות לרגישות פחות לחפצי אמנות הנובעים מתנועה לדוגמה או השפלה, ו-2) יחס מעולה של אות לרעש (SNR). בנוסף, srs מציג ספקטרום זהה ראמאן ספונטנית, ואת האות SRS הוא פרופורציונלי ליניארי לריכוז של הקשר הכימי נרגש^{1,2,3,4, 5}. המשך

במיקרוסקופ שלנו, הגדרת שנייה (fs) SRS ניסיוני משולב עם מיקרוסקופ אופטי הפוך מצויד מראות מהירה יחידת סריקה (איור 1)^6,7,8. שני מקורות לייזר פעמו משמשים ליישום מיקרוסקופ זה. הראשון הוא fs-Ti: Sa עם משך פעימה של כ 140 fs, קצב חזרה של 80 MHz, ואורכי גל פליטה בטווח של 680-1080 nm. השני, המשמש כקרן בדיקה ושאוב על ידי Ti: Sa, היא מתנד פרמטרית מסונכרן האופטי השני (SOPO), עם משך הדופק של כ 200 fs, שיעור חזרה של 80 MHz, ואורכי גל פליטה בטווח של 1000-1600 nm. יצוין כי ההבדל אנרגיית פוטון המינימלי בין Ti: Sa ו-SOPO קורה הוא 2500 ס”מ^-1. לכן, באמצעות שילוב זה של מערכות לייזר, רק בתדירות גבוהה C-H אזור (2800-3200 ס”מ^-1) של ראמאן ספקטרום ניתן לחקור^6,7,8.

כדי להקים מיקרוסקופ SRS יש שלושה נושאים קריטיים לשקול, המתוארים בפסקאות העוקבות. הראשון הוא יישום של שיטת העברת אפנון בתדר גבוה (ראה איור 2 וצעד 2.1 של הפרוטוקול לתיאור). בחקירה ניסויית של SRS, פרמטר חיוני הוא רגישות המערכת. אות SRS מזוהה כשינוי קטן בעוצמת קורות העירור; לכן, זה יכול להיות פגום על ידי רעש לייזר בעוצמה ורעש ירה. ניתן להתגבר על בעיה זו על-ידי שילוב מערכת זו עם שיטת העברת אפנון בתדר גבוה (ראה איור 2 וצעד 2.1 של הפרוטוקול לקבלת פרטים). בשיטה זו, מאופנן אלקטרו-אופטיים (EOM) משמש לווסת את המשאבה. אפנון הועבר קרן בדיקה לאחר מכן ניתן לזהות על ידי משטרת לאחר חסימת קרן המשאבה עם ערימה של מסננים אופטיים [גירוי לצבור ראמאן (SRG) מצב זיהוי]. פלט ה-PD מחובר באמצעות מסנן מעבר נמוך למגבר מנעול (LIA), אשר מדגיש את האות הנמדד. על-ידי הגברת תדירות האפנון של הקרן לתדרים מעל 1 MHz, ניתן להשיג את המגבלה הפנימית של PDs.

הסוגיה השנייה לשקול הוא התקנה של הר מכני אשר מאפשר לבצע זיהוי קדימה באותו זמן כדי לשמר את ההתבוננות במיקרוסקופ ברייטפילד. בנוסף, הוא צריך להפחית את הרעש עקב רטט מכני במהלך הדור של תמונות ולאפשר מיקום מדויק של מערכת האיתור (ראה איור 3 וצעד 2.2 של הפרוטוקול).

השלישי הוא סנכרון האות שנרכש על ידי ערכת האיתור התלויית-פאזה, כאשר הקרן ממוקמת על המדגם הנמצא במעקב על-ידי ראש הסורק של המיקרוסקופ. כדי להגשים תמונות, ה-SMs דורש שלושה אותות TTL שנעשים זמינים על-ידי בקר המיקרוסקופ המחובר ליחידת ראש הסריקה: שעון פיקסל, סנכרון קו, וסנכרון מסגרת. הסנכרון מושג על ידי שליטה באמצעות כרטיס PCI, שלושת אותות הTTL, ורכישת אות מתח בערוץ הפלט של LIA^6,7,8. תוכנה תוצרת בית פותחה ותוארה בעבר^6,7,8, בעוד החומרה של מערכת הסינכרון מדווחת באיור 4.

הליך בסיסי בעת ביצוע הדמיה SRS הוא יישור מיקרוסקופ. היא ממומשת במהלך ארבעת השלבים, המתוארים בפסקאות העוקבות. הראשון הוא חפיפה מרחבית של שתי קורות (ראה שלב 3.1 של הפרוטוקול). בערכה ניסיונית זו, שתי הקורות היו משולבים באופן קוליניארי בשילוב על ידי מראה דיקרואיק. הצעד הראשוני הוא היישור של פופו ו-Ti: Sa כך שכל אחד מהם מגיע למיקרוסקופ. אז, בהתחשב ב-פופו כקרן התייחסות וניצול של גלאי מיקום רגיש, Ti: Sa הוא חופף באופן מהותי ל-פופו.

ההיבט המכריע השני הוא החפיפה הטמפורלית של שתי קורות (ראה שלב 3.2 של הפרוטוקול). גם אם המשאבה ו-פופו קורות מסונכרנים באופן מושלם⁹, מאז הם בעקבות שבילים מעט שונים הקורה בתוך הדיור פופו, ביציאה פופו יש להם עיכוב זמן של כ 5 ns והבדל מרחבי של 5 ס מ. לכן, Ti: Sa ו-פופו דורשות לבצע מחדש את הזמן הקצוב באופן מתוזמן כדי להבטיח חפיפה זמנית במדגם. הדבר מתבצע בדרך כלל עם קו השהיה אופטי הניתן לפעולה דק, אשר במקרה זה מוכנס בין Ti: Sa ומיקרוסקופ (ראה איור 1). על מנת להשיג חפיפה זמנית של שתי קורות, נעשה שימוש בשתי טכניקות. הראשונה מבוצעת באמצעות משטרת מהירה והאוסילוסקופ, בעוד השני מבוסס על מערכת יחסים אוטומטית ומחוצה אופטי. באמצעות הטכניקה הראשונה, חפיפה מחוספס של שתי קורות מושגת (אי ודאות של 10 ps), בעוד החפיפה הזמני מדויק של שתי קורות מושגת באמצעות משתמש חוצה (רזולוציה של 1 fs).

ההיבט העיקרי השלישי הוא יישור של שתי הקורות בתוך המיקרוסקופ (ראה שלב 3.3 של הפרוטוקול). התבוננות מוקדמת באור לבן של המדגם מאפשרת לאינדיבידוקה את השדה הרצוי (FOV). לאחר מכן, קרני לייזר, כניסה למיקרוסקופ על ידי נמל צדדי של מיקרוסקופ, מיושרים על מנת להגיע למשטרה רכוב על החלק העליון (איור 3). עם זאת, עבור רכישת תמונה נכונה, הגדרת מספר פרמטרים נדרש (לדוגמה, מימד פיקסל ופיקסל זמן לשכון). תדר הדגימה חייב לכבד את האילוץ שהוטל על ידי משפט נייקוויסט על מנת לשמר את כל המידע בתמונה, ובמקביל לתכתובת נכונה בין הקואורדינטות המרחבית של פיקסלים לבין ערך SRS הנמדד בכל פיקסל, זמן האינטגרציה של LIA צריכה להיות שווה או דומה לזמן לשכון פיקסל.

בשלב האחרון של יישור מיקרוסקופ, בדיקות רבות מתבצעות כדי לייעל את היישור המרחבי והזמני (ראה שלב 3.4 של הפרוטוקול). מספר תמונות שידור (TI) עבור שתיהן Ti: Sa ו-פופו נרכשים כדי לייעל את החפיפה המרחבית. ב-TI, נעשה שימוש בקרן בודדת, ועוצמת הקרן המועברת מהמדגם נמדדת על-ידי משטרה. במקרה של TI הבינה על-ידי פופו, אות הפלט של PD מחובר ישירות לכרטיס PCI, ואילו במקרה של TI הבינה על-ידי Ti: Sa, אות הפלט של PD מחובר ל-LIA ופלט אנלוגי של LIA מחובר לכרטיס PCI. תמונות השידור שימושיות מאוד כדי למטב את fov, את התאורה, את המיקום המוקד של מטרות מיקרוסקופ וכדי לבדוק אם שתי הקורות הם בעלי שליטת חופפים^6,7,8.

אופטימיזציה של המשאבה ובדיקת חפיפה הזמני של קרן מושגת על ידי סריקת קו ההשהיה עם שלבים של 0.001 מ”מ המתאימים 3.3 fs זמן משמרת וביצוע מדידה SRS בנקודה אחת של מדגם חרוז בפוליסטירן 3 יקרומטר קוטר. השרעת של אות SRS מודדת ערכים מליה, כפונקציה של עיכוב בדיקת המשאבה, והיא מספקת המקבילה המדויקת לחפיפה בזמן המדויק של שתי הקורות^6,7,8. לפני הסיכום, יש לציין כי כל הצעדים הנדונים הם חובה כדי לקבל תמונה באיכות גבוהה.