Implementatie van een niet-lineaire Microscoop op basis van gestimuleerde Raman verstrooiing

In Life Science-toepassingen is SRS microscopie een krachtig hulpmiddel voor label vrije beeldvorming. Het basisidee van SRS microscopie is het combineren van de sterkte van trillational contrast en de mogelijkheid om beelden te verwerven in een paar seconden.

SRS is een proces waarbij het frequentieverschil tussen twee laserstralen frequenties (pomp signaal en Stokes signaal op verschillende frequenties) overeenkomt met de moleculaire trilling van een onderzocht monster, waardoor gestimuleerd Raman verstrooiing en een aanzienlijke verhoging van het Stokes signaal. In tegenstelling tot lineaire Raman-spectroscopie vertoont SRS een niet-lineaire afhankelijkheid van de binnenkomende licht velden en produceert het samenhangende straling. SRS heeft twee fundamentele voordelen: 1) snelheid, waardoor afbeeldingen minder gevoelig zijn voor artefacten die voortvloeien uit monster beweging of degradatie, en 2) een uitstekende signaal-ruis verhouding (SRV). Bovendien vertoont SRS een spectrum dat identiek is aan de spontane Raman, en het SRS-signaal is lineair evenredig aan de concentratie van de chemische obligatie die opgewonden is^{1,2,3,4, 5}.

In onze Microscoop is een femtosecondelaser (FS) SRS experimentele set-up geïntegreerd met een omgekeerde optische Microscoop uitgerust met een snelle spiegels Scanning Unit (Figuur 1)^6,7,8. Twee gepulseerde laserbronnen worden gebruikt om deze Microscoop te implementeren. De eerste is een FS-TI: SA met een puls duur van ongeveer 140 FS, herhalingssnelheid van 80 MHz, en emissie golflengten in het bereik van 680-1080 nm. De tweede, gebruikt als sonde straal en gepompt door TI: SA, is een femtosecondelaser gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (SOPO), met een puls duur van ongeveer 200 FS, herhalingssnelheid van 80 MHz, en emissie golflengten in het bereik van 1000-1600 nm. Opgemerkt moet worden dat de minimale foton energieverschil tussen de TI: SA en Sopo Beam is 2500 cm^-1. Daarom, met behulp van deze combinatie van lasersystemen, kan alleen de hoge frequentie C-H regio (2800-3200 cm^-1) Raman spectra worden verkend^6,7,8.

Om een SRS-Microscoop op te zetten, zijn er drie cruciale punten die in de opeenvolgende paragrafen worden beschreven. De eerste is de implementatie van een High-Frequency modulatie overdrachtsmethode (Zie Figuur 2 en stap 2,1 van het protocol voor een beschrijving). In een SRS-experimenteel onderzoek is een cruciale parameter de gevoeligheid van het systeem. Een SRS-signaal wordt gedetecteerd als een kleine verandering in de intensiteit van excitatie balken; Daarom kan het worden beschadigd door laserintensiteit ruis en schot ruis. Dit probleem kan worden overwonnen door de integratie van dit systeem met een High-Frequency modulatie overdrachtsmethode (Zie Figuur 2 en stap 2,1 van het protocol voor meer informatie). Bij deze methode wordt een elektro-optische modulator (EOM) gebruikt om de pomp te moduleren. De modulatie overgebracht naar de sonde straal kan vervolgens worden gedetecteerd door een PD na het blokkeren van de pomp balk met een stapel optische filters [gestimuleerd Raman Gain (SRG) detectiemodus]. De PD-uitgang wordt met een low pass-filter verbonden aan een lock-in versterker (LIA), die het gemeten signaal demoduleert. Door de modulatie frequentie van de straal naar frequenties boven 1 MHz te verhogen, kan de intrinsieke limiet van PDs worden verkregen.

Het tweede punt dat u moet overwegen is de installatie van een mechanische steun die het mogelijk maakt om voorwaartse detectie uit te voeren en tegelijkertijd de observatie van de Microscoop in brightfield te behouden. Daarnaast moet het geluid verminderen door mechanische trillingen tijdens het genereren van beelden en om de precieze herpositionering van het detectiesysteem mogelijk te maken (Zie Figuur 3 en stap 2,2 van het Protocol).

De derde is de synchronisatie van het signaal dat door het fase gevoelige detectie schema wordt verkregen, waarbij de straal op het monster wordt geplaatst dat door de scan kop van de Microscoop wordt bewaakt. Om afbeeldingen te realiseren, hebben de SMs drie TTL-signalen nodig die beschikbaar worden gesteld door de Microscoop-controller die is aangesloten op de scan hoofdeenheid: pixel klok, lijn synchronisatie en frame synchronisatie. De synchronisatie wordt bereikt door het besturen van een PCI-kaart, de drie TTL-signalen en het verkrijgen van een spanningssignaal op het uitgangskanaal van Lia^6,7,8. Een zelfgemaakte software is ontwikkeld en beschreven eerder^6,7,8, terwijl de hardware van het synchronisatie systeem wordt gerapporteerd in Figuur 4.

Een fundamentele procedure bij het uitvoeren van SRS Imaging is Microscoop uitlijning. Het wordt gerealiseerd in de loop van vier stappen, die in de opeenvolgende alinea’s worden beschreven. De eerste is de ruimtelijke overlapping van twee stralen (zie stap 3,1 van het Protocol). In deze experimentele opstelling, de twee balken waren ruimtelijk collinearly gecombineerd door een dichroïde spiegel. De voorbereidende stap is de uitlijning van OPO en TI: sa zodat elk de Microscoop bereikt. Dan, gezien OPO als een referentie straal en gebruik te maken van een positie gevoelige detector, de TI: SA is ruimtelijk overlapt naar OPO.

Het tweede cruciale aspect is de temporele overlapping van twee stralen (zie stap 3,2 van het Protocol). Zelfs als de pomp en OPO balken zijn perfect gesynchroniseerd⁹, omdat ze iets verschillende straal paden in de OPO behuizing volgen, bij de OPO exit hebben ze een tijdvertraging van ongeveer 5 NS en ruimtelijke verschil van 5 cm. Daarom moeten TI: SA en OPO worden opnieuw getimede met optisch om te zorgen voor tijdelijke overlapping op het voorbeeld. Dit wordt meestal bereikt met een fijnaftunable optische vertragings lijn, die in dit geval tussen de TI: SA en Microscoop wordt ingebracht (Zie Figuur 1). Om de temporele overlap van twee stralen te verkrijgen, worden twee technieken gebruikt. De eerste wordt uitgevoerd met behulp van een snelle PD en oscilloscoop, terwijl de tweede is gebaseerd op auto-en cross-optische correlaties. Met behulp van de eerste techniek wordt een ruwe overlapping van twee stralen verkregen (onzekerheid van 10 PS), terwijl een nauwkeurige temporele overlap van twee stralen wordt verkregen met behulp van een kruis correlator (resolutie van 1 FS).

Het derde cruciale aspect is de uitlijning van de twee stralen in de Microscoop (zie stap 3,3 van het Protocol). Een voorlopige witte licht observatie van het monster maakt het mogelijk om het gewenste gezichtsveld (FOV) te individueren. Daarna worden laserstralen, die de Microscoop door een zijpoort van de Microscoop binnenkomen, uitgelijnd om de PD te bereiken die op het bovenste deel is gemonteerd (Figuur 3). Voor een correcte beeld verwerving is het instellen van een aantal parameters echter vereist (bijvoorbeeld pixeldimensie en pixel dwelltijd). De bemonsteringsfrequentie moet de door de stelling van Nyquist opgelegde beperking respecteren om alle informatie in een afbeelding te behouden, terwijl voor een juiste correspondentie tussen de ruimtelijke coördinaten van pixels en SRS-waarde, gemeten in elke pixel, de integratie tijd van LIA moet gelijk zijn aan of vergelijkbaar zijn met de pixel dwelltijd.

In de laatste stap van de Microscoop-uitlijning worden tal van tests uitgevoerd om de ruimtelijke en temporele uitlijning te optimaliseren (zie stap 3,4 van het Protocol). Een aantal transmissie beelden (TI) voor zowel TI: SA en OPO worden verworven om de ruimtelijke overlap te optimaliseren. In een TI wordt een enkele straal gebruikt, en de uitgezonden straal intensiteit van het monster wordt gemeten door een PD. In het geval van TI gerealiseerd door OPO, het PD-uitgangssignaal is direct verbonden met PCI-kaart, terwijl in het geval van TI gerealiseerd door TI: SA, het PD-uitgangssignaal is aangesloten op LIA en analoge uitgang van LIA is aangesloten op PCI-kaart. De transmissie beelden zijn zeer nuttig voor het optimaliseren van de FOV, de verlichting, de focale positie van de Microscoop doelstellingen en om te controleren of de twee stralen ruimtelijk overlapt^6,7,8.

De optimalisering van de tijds overlap van de pomp en de sonde straal wordt verkregen door het scannen van de vertragings lijn met stappen van 0,001 mm overeenkomend met een 3,3 FS tijdverschuiving en het uitvoeren van een SRS-meting in één punt van een polystyreen kraal monster 3 μm in diameter. De amplitude van een SRS-signaal meetwaarden van Lia, als een functie van de sonde-pomp vertraging, en biedt een maximum overeenkomend met exacte temporele overlapping van de twee stralen^6,7,8. Voordat u afsluit, moet worden opgemerkt dat alle besproken stappen verplicht zijn om een beeld van hoge kwaliteit te verkrijgen.