Implementação de um microscópio não-linear baseado em espalhamento Raman estimulado

Em aplicações da ciência da vida, a microscopia de SRS emergiu como a ferramenta poderosa para a imagem latente Label-Free. A idéia básica da microscopia SRS é combinar a força do contraste vibracional e sua capacidade de adquirir imagens em poucos segundos.

SRS é um processo em que a diferença de frequência entre duas freqüências de feixes de laser (sinal da bomba e sinal Stokes em diferentes frequências) coincide com a vibração molecular de uma amostra investigada, causando dispersão Raman estimulado e uma significativa aumento do sinal Stokes. Ao contrário da Espectroscopia Raman linear, o SRS apresenta uma dependência não linear dos campos de luz recebidos e produz radiação coerente. SRS tem duas vantagens fundamentais: 1) velocidade, o que torna as imagens menos sensíveis aos artefactos resultantes do movimento da amostra ou degradação, e 2) uma excelente relação sinal-ruído (SNR). Além, SRS exibe um espectro idêntico ao Raman espontâneo, e o sinal de SRS é linearmente proporcional à concentração da ligação química excited^{1,2,3,4, a 5}.

Em nosso microscópio, um femtossegundo (FS) SRS experimental set-up é integrado com um microscópio óptico invertido equipado com uma unidade de digitalização de espelhos rápidos (Figura 1)^6,7,8. Duas fontes de laser pulsada são usadas para implementar este microscópio. O primeiro é um FS-ti: SA com uma duração de pulso de aproximadamente 140 FS, taxa de repetição de 80 MHz, e comprimentos de onda de emissão na faixa de 680-1080 nm. O segundo, usado como feixe de sonda e bombeado por ti: SA, é um oscilador paramétrico óptico sincronizado femtossegundo (Sopo), com uma duração de pulso de aproximadamente 200 FS, taxa de repetição de 80 MHz e comprimentos de onda de emissão na faixa de 1000-1600 nm. Deve-se notar que a diferença mínima de energia do fóton entre o feixe ti: SA e SOPO é de 2500 cm^-1. Portanto, usando essa combinação de sistemas a laser, apenas a região C-H de alta frequência (2800-3200 cm^-1) dos espectros Raman pode ser explorada^6,7,8.

A fim estabelecer um microscópio de SRS, há três edições cruciais a considerar, que são descritas nos parágrafos sucessivos. A primeira é a implementação de um método de transferência de modulação de alta frequência (ver Figura 2 e etapa 2,1 do protocolo para uma descrição). Em uma investigação experimental SRS, um parâmetro crucial é a sensibilidade do sistema. Um sinal de SRS é detectado como uma pequena alteração na intensidade dos feixes de excitação; Conseqüentemente, pode ser corrompido pelo ruído da intensidade do laser e pelo ruído do tiro. Esta edição pode ser superada integrando este sistema com um método de transferência de alta freqüência da modulação (veja Figura 2 e etapa 2,1 do protocolo para detalhes). Neste método, um modulador electro-óptico (EOM) é usado para modular a bomba. A modulação transferida para o feixe de sonda pode então ser detectada por um PD depois de bloquear o feixe da bomba com uma pilha de filtros ópticos [estimulado o ganho Raman (SRG) modo de detecção]. A saída PD é conectada por um filtro passa-baixo para um amplificador de bloqueio (LIA), que demodula o sinal medido. Ao aumentar a frequência de modulação do feixe para freqüências acima de 1 MHz, o limite intrínseco do PDs pode ser obtido.

A segunda edição a considerar é a instalação de uma montagem mecânica que permita realizar a deteção para diante e ao mesmo tempo preservar a observação do microscópio no brightfield. Além, tem que reduzir o ruído devido à vibração mecânica durante a geração de imagens e permitir o reposicionamento preciso do sistema de deteção (veja Figura 3 e etapa 2,2 do protocolo).

A terceira é a sincronização do sinal adquirido pelo esquema de detecção sensível à fase, com o feixe posicionado na amostra monitorada pelo cabeçote de varredura do microscópio. A fim realizar imagens, os SMs exigem três sinais do TTL que são disponibilizados pelo controlador do microscópio conectado à unidade da cabeça da varredura: pulso de disparo do pixel, sincronização da linha, e sincronização do frame. A sincronização é conseguida controlando usando um cartão do PCI, os três sinais do TTL, e a aquisição de um sinal da tensão no canal de saída de lia^6,7,8. Um software caseiro foi desenvolvido e descrito anteriormente^6,7,8, enquanto o hardware do sistema de sincronização é relatado na Figura 4.

Um procedimento fundamental ao realizar a imagem latente de SRS é alinhamento do microscópio. Realiza-se ao longo de quatro etapas, que são descritas nos parágrafos sucessivos. A primeira é a sobreposição espacial de duas vigas (ver passo 3,1 do protocolo). Nesta fase experimental, as duas vigas foram combinadas espacialmente por um espelho dicróico. A etapa preliminar é o alinhamento de OPO e de ti: SA de modo que cada um alcangue o microscópio. Em seguida, considerando OPO como um feixe de referência e tirando proveito de um detector de posição sensível, o ti: SA é espacialmente sobreposta a OPO.

O segundo aspecto crucial é a sobreposição temporal de duas vigas (ver passo 3,2 do protocolo). Mesmo se a bomba e os feixes de OPO são perfeitamente sincronizados⁹, uma vez que seguem caminhos de feixe ligeiramente diferentes dentro da habitação opo, na saída opo eles têm um atraso de cerca de 5 ns e diferença espacial de 5 cm. Portanto, ti: SA e OPO exigem re-cronometrado opticamente para garantir a sobreposição temporal na amostra. Isso normalmente é realizado com uma linha de retardo óptico finamente sintonável, que neste caso é inserida entre o ti: SA e o microscópio (veja a Figura 1). A fim de obter a sobreposição temporal de dois feixes, duas técnicas são usadas. O primeiro é realizado usando um PD rápido e osciloscópio, enquanto o segundo é baseado em correlações auto e Cross-Optical. Usando a primeira técnica, uma sobreposição áspera de dois feixes é obtida (incerteza de 10 picosegundo), quando uma sobreposição temporal exata de dois feixes for obtida usando um cross-correlator (definição de 1 FS).

O terceiro aspecto crucial é o alinhamento das duas vigas no interior do microscópio (ver passo 3,3 do protocolo). Uma observação preliminar da luz branca da amostra permite individuar o campo de visão desejado (FOV). Em seguida, os feixes de laser, entrando no microscópio por uma porta lateral do microscópio, são alinhados a fim alcangar o paládio montado na parte superior (Figura 3). No entanto, para uma aquisição de imagem correta, é necessário definir um número de parâmetros (por exemplo, dimensão de pixel e tempo de permanência do pixel). A frequência de amostragem deve respeitar a restrição imposta pelo teorema de Nyquist, a fim de preservar todas as informações em uma imagem, enquanto que para uma correspondência correta entre as coordenadas espaciais de pixels e o valor de SRS medido em cada pixel, o tempo de integração de LIA deve ser igual ou comparável ao tempo de permanência do pixel.

Na etapa final do alinhamento do microscópio, são realizados inúmeros testes para otimizar o alinhamento espacial e temporal (ver etapa 3,4 do protocolo). Uma série de imagens de transmissão (TI) para ti: SA e OPO são adquiridas a fim de otimizar a sobreposição espacial. Em um TI, um único feixe é usado, e a intensidade transmitida do feixe da amostra é medida por um PD. No caso de TI realizado por OPO, o sinal de saída PD está diretamente conectado ao cartão PCI, enquanto no caso de TI realizado por ti: SA, o sinal de saída PD é conectado a LIA e saída analógica de LIA está conectado a placa PCI. As imagens de transmissão são muito úteis para otimizar o FOV, a iluminação, a posição focal dos objetivos do microscópio e verificar se as duas vigas são espacialmente sobrepostas^6,7,8.

A otimização da sobreposição temporal da bomba e do feixe de sonda é obtida através da digitalização da linha de retardo com etapas de 0, 1 mm correspondendo a um deslocamento de tempo de 3,3 FS e realizando uma medição de SRS em um único ponto de uma amostra de grânulo de poliestireno de 3 μm de diâmetro. A amplitude de um sinal de SRS mede valores de lia, em função do retardo da sonda-bomba, e fornece um máximo correspondente com a sobreposição temporal exata das duas vigas^6,7,8. Antes de concluir, deve-se notar que todas as etapas discutidas são obrigatórias para obter uma imagem de alta qualidade.