Funcionalización de voladizos de microscopio de fuerza atómica con células de una t o de una sola partícula para espectroscopia de fuerza de una sola célula inmunológica

La microscopía de fuerza atómica (AFM), una herramienta versátil, ha encontrado muchas aplicaciones en la investigación de biología celular^1,2,3,4,5. Aparte de su capacidad de imagen de alta resolución, la función nativa de sondeo de fuerza permite investigar directamente las propiedades biofísicas de las células vivas in situ en el nivel^6deuna sola célula,^7. Estas incluyen las rigideces de las estructuras subcelulares o incluso células enteras^8,9,10,11,12, ligando /receptor específico nivel de molécula única en la superficie celular¹³, y fuerzas de adhesión entre pares únicos de partículas sólidas y células o entre dos células^1,2,14,15. Estos dos últimos se clasifican a menudo como espectroscopía de fuerza de una sola célula (SCFS)¹⁶. Debido a los voladizos fácilmente disponibles con varias constantes de resorte, el rango de fuerza accesible para AFM es bastante amplio desde unos piconewtons (pN) hasta micronewtons (N), que cubre adecuadamente toda la gama de eventos celulares que involucran fuerzas de unas pocas decenas de pN, como la unión de una sola molécula basada en receptores, a nN, como los eventos celulares fagocíticos¹⁵. Este gran rango de fuerza dinámica hace que el AFM sea ventajoso sobre otras técnicas de sondeo de fuerza, como pinzas ópticas/magnéticas y una sonda de fuerza de biomembrana, ya que son más adecuados para mediciones de fuerza débil, con una fuerza típicamente inferior a 200 pN^{17 , 18}. Además, AFM puede funcionar como un manipulador de alta precisión para entregar varios estímulos en células individuales de una manera espaciotemporalmente definida^4,19. Esto es deseable para los estudios de activación de una sola célula en tiempo real. En combinación con las imágenes de fluorescencia de células vivas, la respuesta celular posterior al estímulo específico se puede monitorear simultáneamente, haciendo que el SCFS basado en AFM sea extremadamente robusto como imágenes ópticas que proporcionan una herramienta práctica para sondear la señalización celular. Por ejemplo, AFM se utilizó para determinar las cepas necesarias para obtener transitorios de calcio en osteoblastos²⁰. En este trabajo, los transitorios de calcio fueron rastreados fluorescentemente a través de imágenes métricas de relación de calcio después de la aplicación de fuerzas localizadas en osteoblastos cultivados con una punta de AFM. Recientemente, se empleó AFM para estirar fibrillas de colágeno en las que se cultivaban células estelares hepáticas (HSC) y esta activación de HSC transducida por mecano fue monitoreada en tiempo real por un biosensor fluorescente Src, cuya fosforilación representada por el la intensidad de la fluorescencia del biosensor está correlacionada con la activación de HSC³.

En los experimentos SCFS basados en AFM, la funcionalización adecuada de los voladizos AFM es un paso clave hacia mediciones exitosas. Dado que nuestro interés en la investigación se centra en la activación de las células inmunitarias, funcionalizamos rutinariamente losvoladizos con partículas, como partículas sólidas individuales que pueden desencadenar fagocitosis y/o respuestas inmunitarias fuertes 4,^{14 , 15} y células T únicas que pueden formar una sinapsis inmune con células que presentan antígeno, como células dendríticas activadas (DC)². Las partículas sólidas individuales normalmente se acoplan a un voladizo a través de un pegamento epoxi en el entorno del aire, mientras que las células T individuales, debido a su naturaleza no adhesiva, se funcionalizan a un voladizo a través de un pegamento biocompatible en solución. Aquí, describimos los métodos para realizar estos dos tipos de modificación en voladizo y dar dos aplicaciones asociadas también. La primera aplicación es sondear las interacciones de células T/DC con AFM-SCFS para comprender el mecanismo supresor de las células T reguladoras desde el punto de vista de la mecánica celular. El segundo consiste en combinar AFM con imágenes de fluorescencia de células vivas para monitorear la respuesta celular de macrófagos a una partícula sólida en tiempo real para revelar el mecanismo molecular de fosfatidilinositol independiente del receptor 4,5-bisfosfato (PIP2)- La moesina mediaba en la fagocitosis. El objetivo de este protocolo es proporcionar un marco de referencia para que los investigadores interesados diseñen e implementen sus propios entornos experimentales con análisis de una sola célula basados en AFM para la investigación inmunológica.