Функционализация атомной силы Микроскоп Кантилеверс с одно-T-клеток или одночастицы для иммунологической одноклеточной силы спектроскопии

Атомная микроскопия силы (AFM), универсальный инструмент, нашелмного применений в исследованиях клеточной биологии 1,^2,3,4. Помимо своей высокой возможности изображения разрешения, родная функция зондирования силы позволяет биофизические свойства живых клеток, которые будут исследованы непосредственно на месте на одноклеточном уровне^6,7. К ним относятся жесткости субклеточныхструктур или даже целые клетки 8,^9,10,11,12, конкретные лиганд / рецептор связывания сильные силы на одномолекулярный уровень на поверхности клетки^13,и силы стыковки междуоднопартными парами твердых частиц и клеток или между двумя клетками 1,^2,14,15. Последние два часто классифицируются как одноклеточная спектроскопия силы (SCFS)¹⁶. Благодаря легкодоступным кантилеверам с различными весенними константами диапазон сил, доступный для AFM, довольно широк от нескольких пиконевтонов (pN) до микроньютонов (кН), который адекватно покрывает весь спектр клеточных событий, включающих силы из нескольких десятков pN, таких как рецептор на основе одномолекулярных связывания, на nN, таких как фагоцитные клеточные события¹⁵. Этот большой динамический диапазон сил делает AFM выгодным по сравнению с другими методами зондирования силы, такими как оптические/магнитные пинцеты и биомембранный зонд силы, так как они больше подходят для измерений слабой силы, с силой, как правило, менее 200 pN^{17 , 18}. Кроме того, AFM может функционировать как высокоточный манипулятор для доставки различных стимулов на одиночные клетки в пространственно определенным образом^4,19. Это желательно для проведения одноклеточных исследований в режиме реального времени. В сочетании с живой клеткой флуоресценции изображения, последующая клеточная реакция на конкретные стимулы могут контролироваться одновременно, что делает AFM основе SCFS чрезвычайно надежным, как оптические изображения, обеспечивая практический инструмент для зондирования клеточной сигнализации. Например, AFM был использован для определения штаммов, необходимых для получения преходящей кальция в остеобластах²⁰. В этой работе, переходные кальция были отслежены флуоресцентно через кальций коэффициентметрической визуализации после применения локализованных сил на культивированных остеобластов с aFM отзыв. Недавно AFM был использован для растяжения колагенных фибрилков, на которых были выращены печеночные клетки стеллата (HSC), и эта механо-трансиндуцированная активация HSC в режиме реального времени контролировалась флуоресцентным биосенсором Src, фосфорилирование которого представлено Интенсивность флуоресценции биосенсора коррелирует с активацией HSC^3.

В экспериментах SCFS на основе AFM правильная функционализация кантилеверов AFM является ключевым шагом на пути к успешным измерениям. Так как наш исследовательский интерес фокусируется на активации иммунных клеток, мы регулярно функционализируем кантилеверы с твердыми частицами, такими как отдельные твердые частицы, которые могут вызвать фагоцитоз и/или сильные иммунные реакции^{4,14 , 15} и одиночные Т-клетки, которые могут образовывать иммунный синапс с антигеном, представляя клетки, такие как активированные дендритные клетки (DC)². Одиночные твердые частицы нормально соединены к cantilever через эпоксидный клей в окружающей среде воздуха, тогда как одиночные клетки T, из-за их non-клейкого природы, функционализированы к cantilever через биосовместимый клей в растворе. Здесь мы описываем методы выполнения этих двух типов модификации кантилевера и даем два связанных приложения. Первое приложение заключается в зондировании взаимодействий Т-клеток/DC с AFM-SCFS, чтобы понять подавляющий механизм регуляторных Т-клеток с точки зрения механики клеток. Второй включает в себя сочетание AFM с живой клеткой флуоресценции изображения для мониторинга клеточной реакции макрофага на твердую частицу в режиме реального времени, чтобы выявить молекулярный механизм рецептор-независимый фосфатидинозинол 4,5-бисфосфат (PIP2)- Моезин опосредованный фагоцитоз. Цель этого протокола заключается в том, чтобы обеспечить ориентировочную основу для заинтересованных исследователей для разработки и реализации своих собственных экспериментальных настроек с AFM на основе одноклеточного анализа для иммунологических исследований.