Summary

Funzionalizzazione dei cantilever a microscopio a forza atomica con cellule A T singole o a particella singola per la spettroscopia immunologica a forza a cella singola

Published: July 10, 2019
doi:

Summary

Presentiamo un protocollo per funzionalizzare i cantilever a forza atomica (AFM) con una singola cellula T e particelle di perline per studi immunologici. Vengono mostrate le procedure per sondare il legame di cellula-cellula T a una singola coppia da parte di AFM e per monitorare la risposta cellulare in tempo reale dei macrofagi a una singola particella solida da AFM con imaging a fluorescenza.

Abstract

La spettroscopia a forza cellulare atomica (AFM-SCFS) è un potente strumento per studiare le proprietà biofisiche delle cellule viventi. Questa tecnica consente di sondare i punti di forza e la dinamica di interazione su una membrana cellulare viva, compresi quelli tra le cellule, il recettore e i ligandi, e insieme a molte altre variazioni. Funziona anche come meccanismo per fornire uno stimolo fisico o biochimico su singole cellule in modo spatiotemporalmente controllato, consentendo così l’attivazione di cellule specifiche e i successivi eventi cellulari da monitorare in tempo reale quando combinati con le cellule vive l’imaging a fluorescenza. Il passo chiave in queste misurazioni AFM-SCFS è la funzionalizzazione a sbalzo AFM, o in altre parole, allegando un argomento di interesse al cantilever. Qui, presentiamo metodi per modificare i cantilever AFM con una singola cellula T e una singola perla di polistirolo rispettivamente per gli studi immunologici. Il primo prevede una colla biocompatibile che associa singole cellule T alla punta di uno sbalzo piatto in una soluzione, mentre la seconda si basa su una colla epossidica per l’adesione a perline singola nell’ambiente atmosferico. Vengono fornite anche due applicazioni immunologiche associate a ogni modifica a sbalzo. I metodi qui descritti possono essere facilmente adattati a diversi tipi di cellule e particelle solide.

Introduction

La microscopia a forza atomica (AFM), uno strumento versatile, ha trovato molte applicazioni nella ricerca sulla biologia cellulare1,2,3,4,5. Oltre alla sua capacità di imaging ad alta risoluzione, la funzione nativa di sonda di forza consente di studiare direttamente le proprietà biofisiche delle cellule viventi in situ al livello a cella singola6,7. Questi includono le rigidità delle strutture subcellulari o anche le cellule intere8,9,10,11,12, specifici punti di forza di legamento / recettore livello di singola molecola sulla superficie cellulare13, e le forze di adesione tra singole coppie di particelle solide e cellule o tra due cellule1,2,14,15. Questi ultimi due sono spesso classificati come spettroscopia a forza singola (SCFS)16. A causa dei cantilever prontamente disponibili con varie costanti primaverili, la gamma di forza accessibile all’AFM è piuttosto ampia da pochi piconewtons (pN) a micronewton (N), che copre adeguatamente l’intera gamma di eventi cellulari che coinvolgono forze di poche decine di pN, come il legame a singola molecola basato sul recettore, a nN, come gli eventi cellulari fagocitici15. Questa vasta gamma di forza dinamica rende l’AFM vantaggioso rispetto ad altre tecniche di sonda di forza come le pinzette ottiche/magnetiche e una sonda di forza biomembrana, in quanto sono più adatte per misurazioni a forza debole, con forza tipicamente inferiore a 200 pN17 , 18.Inoltre, l’AFM può funzionare come manipolatore ad alta precisione per fornire vari stimoli su singole celle in modo spatiotemporale4,19. Questo è auspicabile per gli studi di attivazione di una singola cellula in tempo reale. In combinazione con l’imaging a fluorescenza delle cellule vive, la successiva risposta cellulare allo stimolo specifico può essere monitorata contemporaneamente, rendendo così SCFS basato su AFM estremamente robusto come imaging ottico che fornisce uno strumento pratico per sondare la segnalazione cellulare. Per esempio, AFM è stato utilizzato per determinare i ceppi necessari per suscitare transitori di calcio negli osteoblasti20. In questo lavoro, i transitori di calcio sono stati tracciati fluorescente attraverso l’imaging ratiometrico del calcio dopo l’applicazione di forze localizzate su osteoblasti coltivati con una punta AFM. Recentemente, AFM è stato impiegato per allungare fibrille di collagene su cui sono state coltivate cellule epatiche stellate (HSC) e questa attivazione di HSC trassedanti mechano è stata monitorata in tempo reale da un biosensore Src fluorescente, la cui fosforolazione come l’intensità di fluorescenza del biosensore è correlata all’attivazione HSC3.

Negli esperimenti SCFS basati su AFM, una corretta funzionalizzazione dei cantilever AFM è un passo fondamentale verso misurazioni di successo. Dal momento che il nostro interesse di ricerca si concentra sull’attivazione delle cellule immunitarie, abbiamo regolarmente funzionalizzante i sbalzioni con particolato come singole particelle solide che possono innescare la fagocitosi e/o forti risposte immunitarie4,14 , 15 e singole cellule T che possono formare una sinapsi immunitaria con antigene che presenta cellule, come le cellule dendritiche attivate (DC)2. Le singole particelle solide sono normalmente accoppiate a un cantilever tramite una colla epossidica nell’ambiente atmosferico, mentre le singole cellule T, a causa della loro natura non adesiva, sono funzionalizzate a un sbalzo tramite una colla biocompatibile in soluzione. Qui, descriviamo i metodi per eseguire questi due tipi di modifica a sbalzo e diamo anche due applicazioni associate. La prima applicazione è quella di sondare le interazioni tra cellule T e DC con AFM-SCFS per comprendere il meccanismo soppressivo delle cellule T regolatorie dal punto di vista della meccanica cellulare. Il secondo consiste nel combinare AFM con l’imaging a fluorescenza a cellule vive per monitorare la risposta cellulare del macrofago a una particella solida in tempo reale per rivelare il meccanismo molecolare del fosfatoindipendentene 4,5-bisphofosfatolo 4,5-bisphosphatel (PIP2)- Moesin mediava la fagocitosi. L’obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un quadro di riferimento per i ricercatori interessati per progettare e implementare le proprie impostazioni sperimentali con l’analisi unicellulare basata su AFM per la ricerca immunologica.

Protocol

Il protocollo di sperimentazione dei topi segue le linee guida per la cura degli animali dell’Università di Tsinghua 1. Funzionalizzazione a sbalzo con singole cellule T Preparazione delle cellule di milza del topo Sacrificare il topo (8-16 settimane di età (entrambi i sessi); ceppo C57BL/6) utilizzando anidride carbonica, seguita da lussazione cervicale. Pulire il mouse con il 75% di etanolo e fare un’incisione della pelle midline seguita da splenectomia. …

Representative Results

La figura 4A mostra le tipiche curve di distanza della forza dall’interazione di legame tra cella a T singola e single-DC in un ciclo di avvicinamento-retratto. La curva rosso chiaro è la curva di estensione e quella rossa scura è la curva di retrazione. Poiché la curva di estensione viene in genere utilizzata per l’indentazione o l’analisi della rigidità, qui si tratta solo della curva di retrazione per l’adesione cellulare. Il valore minimo (il cerchio …

Discussion

La spettroscopia a forza singola basata su AFM si è evoluta per essere un potente strumento per affrontare le proprietà biofisiche delle cellule viventi. Per tali applicazioni, il cantilever deve essere funzionalizzato correttamente al fine di sondare interazioni o proprietà specifiche sulle cellule di interesse. Qui, i metodi per l’accoppiamento di una singola cellula T e di un singolo tallone di dimensioni micron al cantilever senza punta sono descritti rispettivamente. Per attaccare una singola cellula T al cantile…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è supportato dal National Natural Science Foundation of China General Program (31370878), dal State Key Program (31630023) e dal Innovative Research Group Program (81621002).

Materials

Material
10 μl pipette tip Thermo Fisher 104-Q
15 ml tube Corning 430791
6 cm diameter culture dish NALGENE nunc 150462
6-well culture plate JET TCP011006
AFM Cantilever NanoWorld Arrow-TL1-50 tipless cantilever
β-Mercaptoethanol Sigma 7604
Biocompatible glue BD Cell-Tak 354240
CD4+ T cell isolation Cocktail STEMCELL 19852C.1
DC2.4 cell line A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)
Dextran-coated magnetic particles STEMCELL SV30010
EDTA GENEray Generay-E1101-500 ml
Epoxy ERGO 7100
Ethanol twbio 00019
FBS Ex Cell Bio FSP500
FcR blocker STEMCELL 18731
Glass coverslip local vender (Hai Men Lian Sheng) HX-E37 24mm diameter, 0.17mm thinckness
Glass slides JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen  N/A customized
H2O2 (30%) Sino pharm 10011218
H2SO4 Sino pharm 80120892
HEPES Sigma 51558
Magnet STEMCELL 18000
Mesh nylon strainer BD Falcon REF 352350
Moesin-EGFP N/A cloned in laboratory
Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit STEMCELL 18782 Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres,
Mouse CD4+ Tcell isolation kit STEMCELL 19852 Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum
NaOH Lanyi chemical products co., LTD, Beijing 1310-73-2
PBS Solarbio P1022-500
PE selection cocktail STEMCELL 18151
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010
PLCδ-PH-mCherry Addgene 36075
Polystyrene microspheres 6.0μm Polysciences 07312-5
polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
Rat serum STEMCELL 13551
RAW264.7  ATCC
Recombinant Human Interleukin-2 Peprotech Peprotech, 200-02-1000
Red blood cell lysis buffer Beyotime C3702
Regulatory T cell positive selection cocktail STEMCELL 18782C
RPMI 1640 Life C11875500BT
Sample chamber Home made
Streptavidin-coated magnetic particles STEMCELL 50001
Transfection kit Clontech 631318
Trypsin 0.25% EDTA Life 25200114
Tweezers JD N/A
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
20x objective NA 0.8 Zeiss 420650-9901 Plan-Apochromat
Atomic force microscope JPK cellHesion200
Centrifuge Beckman coulter Allegra X-12R
Fluorescence imaging home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand
Humidified CO2 incubator Thermo Fisher HERACELL 150i
Inverted light microscope Zeiss Observer A1 manual

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Cite This Article
Chen, J., Xu, Y., Shi, Y., Xia, T. Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59609, doi:10.3791/59609 (2019).

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