Funktionalisierung von Atomkraftmikroskop-Auslegern mit Einzel-T-Zellen oder Einzelpartikeln für die immunologische Einzelkraftspektroskopie

Atomkraftmikroskopie (AFM), ein vielseitiges Werkzeug, hat viele Anwendungen in der Zellbiologie Forschung^{gefunden 1,2,3,4,5}. Neben der hochauflösenden Bildgebungsfunktion ermöglicht die native Kraft-Probing-Funktion die direkte Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften lebender Zellen direkt vor Ort auf der einzelzelligen Ebene^6,7. Dazu gehören die Steifigkeiten subzellulärer Strukturen oder sogar ganzer Zellen^8,9,10,11,12, spezifische Liganden/Rezeptor-Bindungsstärken an der Einzelmolekülebene auf der Zelloberfläche¹³, und Haftkräfte zwischen Einzelpaaren von Festen Partikeln und Zellen oder zwischen zwei Zellen^1,2,14,15. Die beiden letztgenannten sind oft als einzellige Kraftspektroskopie (SCFS)¹⁶kategorisiert. Aufgrund der leicht verfügbaren Ausleger mit unterschiedlicher Federkonstante ist der für AFM zugängliche Kraftbereich von wenigen Piconewtons (pN) bis zu Mikronewtons (N) recht breit, was die gesamte Bandbreite der zellulären Ereignisse mit Kräften von wenigen Dutzenden angemessen abdeckt. pN, wie z. B. rezeptorbasierte Einzelmolekülbindung, an nN, wie z. B. phagozytische zelluläre Ereignisse¹⁵. Dieser große dynamische Kraftbereich macht AFM vorteilhaft gegenüber anderen Kraft-Probing-Techniken wie optischer/magnetischer Pinzette und einer Biomembran-Kraftsonde, da sie besser für Schwachkraftmessungen geeignet sind, mit einer Kraft von typischerweise weniger als 200 pN^{17. , 18}. Darüber hinaus kann AFM als hochpräziser Manipulator fungieren, um verschiedene Reize auf einzelne Zellen in einer räumlich definierten Weise zu liefern^4,19. Dies ist für die Einzelzellaktivierungsstudien in Echtzeit wünschenswert. In Kombination mit livezelliger Fluoreszenz-Bildgebung kann die nachfolgende zelluläre Reaktion auf den spezifischen Reiz gleichzeitig überwacht werden, wodurch AFM-basiertes SCFS als optische Bildgebung äußerst robust ist und ein praktisches Werkzeug zur Untersuchung der zellulären Signalisierung bietet. Zum Beispiel wurde AFM verwendet, um die Stämme zu bestimmen, die erforderlich sind, um Kalziumtransienten in Osteoblasten zu entlocken²⁰. In dieser Arbeit wurden Kalziumtransienten fluoreszierend durch Kalzium-Ratiometrische Bildgebung nach der Anwendung lokalisierter Kräfte auf kultivierte Osteoblasten mit einer AFM-Spitze verfolgt. Kürzlich wurde AFM eingesetzt, um Kollagenfibrillen zu dehnen, auf denen hepatische Stellatzellen (HSC) angebaut wurden, und diese mechano-transdued HSC-Aktivierung wurde in Echtzeit von einem fluoreszierenden Src-Biosensor überwacht, dessen Phosphorylierung Fluoreszenzintensität des Biosensors korreliert mit HSC-Aktivierung³.

In AFM-basierten SCFS-Experimenten ist die richtige Funktionalisierung von AFM-Auslegern ein wichtiger Schritt zu erfolgreichen Messungen. Da sich unser Forschungsinteresse auf die Aktivierung von Immunzellen konzentriert, funktionalisieren wir routinemäßig Ausleger mit Partikeln wie einzelnen Feststoffpartikeln, die Phagozytose und/oder starke Immunantworten auslösen können^{4,14 , 15} und einzelne T-Zellen, die eine Immunsynapse mit Antigen-präsentierenden Zellen bilden können, wie aktivierte dendritische Zellen (DC)². Einzelne Feststoffpartikel werden in der Regel über einen Epoxidkleber in der Luftumgebung an einen Ausleger gekoppelt, während einzelne T-Zellen aufgrund ihrer nicht klebenden Natur über einen biokompatiblen Klebstoff in Lösung zu einem Ausleger funktionalisiert werden. Hier beschreiben wir die Methoden, um diese beiden Arten von Freischwinger-Modifikationen durchzuführen und geben auch zwei zugehörige Anwendungen. Die erste Anwendung besteht darin, T-Zell-/DC-Wechselwirkungen mit AFM-SCFS zu untersuchen, um den Unterdrückungsmechanismus von regulatorischen T-Zellen aus der Sicht der Zellmechanik zu verstehen. Die zweite beinhaltet die Kombination von AFM mit Live-Zell-Fluoreszenz-Bildgebung, um die zelluläre Reaktion von Makrophagen auf ein festes Teilchen in Echtzeit zu überwachen, um den molekularen Mechanismus des rezeptorunabhängigen Phosphatidylinositols 4,5-Bisphosphat (PIP2)- Moesin vermittelte Phagozytose. Ziel dieses Protokolls ist es, interessierten Forschern einen Bezugsrahmen für die Konzeption und Umsetzung ihrer eigenen experimentellen Einstellungen mit AFM-basierter einzelliger Analyse für die immunologische Forschung zu bieten.