הפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי מנופים עם תאים חד-טי או חלקיק יחיד לספקטרוסקופיית של כוח בודד אימונולוגיים
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התלויה מנופים עם תא T יחיד וחלקיק חרוז למחקרים אימונולוגיים. הליכים לחקור בודד זוג תא תא דנדריטי כריכה על ידי AFM ולפקח על התגובה התאית בזמן אמת של מקרופאגים לחלקיק אחיד אחד על ידי AFM עם הדמיה פלואורסצנטית מוצגים.
Abstract
מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM-SCFS) הוא כלי רב עוצמה ללימוד תכונות ביופיזיקלי של תאים חיים. טכניקה זו מאפשרת הידברות בדיקה ודינמיקה על קרום התא חי, כולל אלה בין תאים, קולטן וליגטים, לצד וריאציות רבות אחרות. זה גם עובד כמנגנון לספק גירוי פיסי או ביוכימיים על תאים בודדים בצורה מבוקרת spatioזמניות, ובכך לאפשר הפעלה תא ספציפית ואירועים סלולריים הבאים להיות מנוטרים בזמן אמת בשילוב עם לחיות תא הדמיה פלואורסצנטית. הצעד העיקרי במידות ה-AFM-SCFS הוא הפונקציונליזציה של ה-AFM-זיז, או במילים אחרות, ומצרף נושא מעניין לזיז. כאן, אנו מציגים שיטות כדי לשנות את מנוף AFM עם תא T אחד ו פוליסטירן בודד חרוז בהתאמה למחקרים אימונולוגיים. הראשון כרוך דבק ביולוגי תואם זוגות תאים T יחיד לקצה של זיז שטוח בפתרון, בעוד האחרון מסתמך על דבק אפוקסי על הדבקה אחת חרוז בסביבה האוויר. שני יישומים אימונולוגיים הקשורים לכל שינוי שלוחה מסופקים גם כן. השיטות המתוארות כאן יכולות להתאים בקלות לסוגי תאים שונים ולחלקיקים מוצקים.
Introduction
מיקרוסקופ כוח אטומי (afm), כלי רב-תכליתי, מצא יישומים רבים במחקר ביולוגיה תא1,2,3,4,5. מלבד יכולת הדימות שלה ברזולוציה גבוהה, התכונה הטבעית בודק כוח מאפשר ביופיזיקלי מאפיינים של תאים חיים להיחקר ישירות באתרו בתא יחיד ברמה6,7. אלה כוללים את מרכיבי הרוח של מבנים subcellular או אפילו תאים שלמים8,9,10,11,12, מסוימים מחייב ליגפני/קולטן החוזקות ב רמת מולקולה בודדת על פני השטח של התא13, וכוחות הדבקה בין זוגות בודדים של חלקיקים מוצקים ותאים או בין שני תאים1,2,14,15. שני האחרונים מסווגים בדרך כלל כספקטרוסקופיית כוח בודד (SCFS)16. בשל מנוף התלויה זמין עם קבוע באביב שונים, טווח הכוח נגיש AFM הוא רחב למדי מכמה piconewtons (pN) כדי מיקרוונטונים (μN), אשר מכסה כראוי את כל מגוון של אירועים סלולריים מעורבים כוחות מכמה עשרות של pN, כגון כריכת מולקולה בודדת מבוססת-קולטן, ל-nN, כגון אירועים סלולריים phagocytic15. זה טווח כוח דינאמי גדול עושה יתרון AFM על טכניקות אחרות כוח לחטט כגון מלקחיים אופטיים/מגנטיים ו biomembrane כוח בדיקה, כפי שהם מתאימים יותר מדידות כוח חלש, עם כוח בדרך כלל פחות מ 200 pN17 , 18. בנוסף, afm יכול לתפקד כמו מניפולטור בדיוק גבוהה כדי לספק גירויים שונים על תאים בודדים באופן מוגדר בצורה מוגדרת4,19. הדבר רצוי עבור לימודי הפעלה בזמן אמת של תא יחיד. בשילוב עם הדמיה לחיות בתאים הפלואורסצנטית, את התגובה התאית הבאה לגירוי מסוים ניתן לנטר בו, ובכך לבצע SCFS מבוססי מאוד חזק כמו דימות אופטי מתן כלי מעשי לחקור איתות סלולרי. למשל, AFM שימש כדי לקבוע את הזנים הדרושים כדי לעורר ארעיות סידן באוסטאואורך20. בעבודה זו, מעבר סידן מסומנים פלואורומטרים באמצעות הדמיה מטימטרי סידן לאחר היישום של כוחות מותאמים לשפות אחרות על האוסטאופיה מתורבת עם טיפ AFM. לאחרונה, afm הועסק מתיחה סיבים קולגן על אשר תאים stellate הכבד (hsc) גדלו ואת זה מכונאי הפעלה hsc ההפעלה היתה בזמן אמת מפוקח על ידי פלורסנט Src ביוסנסור, אשר זירחון כפי שמיוצג על ידי האינטנסיביות הפלואורסצנטית של ביוסנסור מתואם עם hsc הפעלה3.
בניסויי SCFS מבוססי AFM, הפונקציונליזציה הנכונה של מנופים של AFM התלויה הוא צעד מפתח לקראת מדידות מוצלחות. מאז אינטרס המחקר שלנו מתמקד הפעלה של תאים חיסוניים, אנחנו באופן שגרתי מנופים התלויים עם חומר חלקיקי כגון חלקיקים מוצק אחד שיכול להפעיל phagocyציטוזה ו/או תגובות החיסון חזק4,14 , 15 ותאי T בודדים שיכולים ליצור סינפסה החיסונית עם הצגת התאים אנטיגן, כגון תאים דנדריטים המופעל (DC)2. חלקיקים מוצקים בודדים מצמידים בדרך כלל לזיז באמצעות דבק אפוקסי בסביבה האוויר, ואילו תאים T בודדים, בשל האופי שלהם שאינם דבקים, הם פונקציונל באמצעות דבק ביולוגי בפתרון. כאן, אנו מתארים את השיטות לבצע שני סוגים אלה של שינוי זיז ולתת שני יישומים משויכים גם. האפליקציה הראשונה היא לחקור אינטראקציות T cell/DC עם AFM-SCFS כדי להבין את המנגנון המדכא של תאי T הרגולציה מנקודת המבט של מכניקת התא. השני כולל שילוב של AFM עם הדמיה לחיות בתאים פלואורסצנט כדי לפקח על התגובה התאית של מקרופאג כדי חלקיק מוצק בזמן אמת כדי לחשוף את המנגנון המולקולרי של הקולטן פוספולידיליליניום 4, 5-ביספושוונאים (PIP2)- . מוסין מתווכת הפייגוציטוזה מטרת פרוטוקול זה היא לספק מסגרת התייחסות לחוקרים מעוניינים לעצב וליישם הגדרות הניסוי שלהם עם מבוססי AFM ניתוח תא בודד עבור מחקר אימונולוגיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM מבוססי תא בודד ספקטרוסקופיית התפתח להיות כלי רב עוצמה כדי לטפל במאפיינים הביופיסיים של תאים חיים. עבור יישומים אלה, הזיז צריך להיות מתפקד כראוי על מנת לחקור אינטראקציות או מאפיינים ספציפיים על תאי העניין. כאן, השיטות לצימוד תא T יחיד וחרוז מיקרון בגודל יחיד לזיז הפחות-טיפ מתוארים בהתאמה….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין התוכנית הכללית (31370878), תוכנית מפתח המדינה (31630023) ותוכנית קבוצת מחקר חדשנית (81621002).
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
References
- Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
- Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
- Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
- Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
- Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
- Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
- Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
- Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
- Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
- Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
- Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).
- Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
- Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
- Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
- Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) – a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
- Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
- Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
- Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
- Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
- Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).
