توطين البروتينات المعدلة السومو باستخدام السومو الفلورسنت-البروتينات الملائمة
Summary
السومو هو البروتين المعدل الأساسي والمحفوظ بشكل كبير والصغير الحجم. في هذا البروتوكول ، نقوم بوصف استخدام بروتين التراكب السومو الذي يتسامح مع الإجهاد (kmUTAG) لتصور الاصليه ، وغير الموسومة السومو الاقتران وتوطينها في مجموعه متنوعة من أنواع الخلايا.
Abstract
هنا نقدم طريقه جديده لدراسة البروتينات وتوطينها شبه الخلوي في خلايا الثدييات والبويضات الخيطية. هذا الأسلوب يستخدم المؤتلف تعديل السومو-محاصره جزء من البروتين, kmUTAG, المستمدة من الانزيم البروتيني Ulp1 السومو من الخميرة الناشئة المتسامحة الإجهاد كلوفيريميسسيس ماركسيانوس. لقد قمنا بتكييف خصائص kmUTAG لغرض دراسة sumoylation في مجموعه متنوعة من النظم النموذجية دون استخدام الأجسام المضادة. لدراسة السومو ، KmUTAG لديها العديد من المزايا بالمقارنة مع النهج المستندة إلى الأجسام المضادة. يتم إنتاج هذا الكاشف المتسامح مع الإجهاد السومو ريكومبينانتلي ، فانه يعترف ايسواشكال السومو الأصلي من العديد من الأنواع ، وعلي عكس الأجسام المضادة المتاحة تجاريا فانه يظهر انخفاض تقارب لحره ، السومو غير مترافق. وتشمل النتائج التمثيلية المبينة هنا توطين الاقترانات السومو في خلايا ثقافة الانسجه الثديية والبويضات الخيطية.
Introduction
والغرض من هذا الأسلوب هو تسهيل دراسة وتحليل البروتينات المترافقة السومو باستخدام المؤتلف السومو التراكب UTAG (Ulp علامةالمجال) البروتين. كما هو مفصل أدناه ، يمكن استخدام UTAG بدلا من الكواشف الأخرى والنهج لتنقيه وكشف وتصور البروتينات المعدلة السومو. اعتمادا علي ظروف النمو ، قد تحتوي الخلايا علي مئات أو آلاف البروتينات التي يتم تعديلها باستخدام سلاسل السومو أو السومو (للمراجعة انظر Kerscher et al. 20061 و kerscher 20162). وهذا يمثل صعوبة كبيره بالنسبة للتحليلات الوظيفية للبروتينات المعدلة السومو محدده, خصوصا ان جزءا فقط من هدف sumoylation معينه هو في الواقع تعديل3. بالاضافه إلى أدوارهم في العمليات الخلوية الاساسيه مثل التنظيم العابر ، توازن البروتين ، والاستجابة للإجهاد الخلوي ، وأعاده عرض الكروماتين اثناء الانقسام والانقسام العصبي ؛ أصبح من الواضح الآن بما فيه الكفاية ان السومو ، السومو-البروتينات المعدلة ، ومكونات مسار السومو أيضا لديها إمكانات كما المؤشرات الحيوية للامراض مثل السرطان واضطرابات الأعصاب4،5،6 ،7. وهذا يؤكد الحاجة إلى أدوات قويه وموثوقه ومتاحه بسهوله ونهج مبتكره للكشف والتحليل الوظيفي للبروتينات المعدلة السومو في مجموعه متنوعة من الخلايا والعينات.
في العديد من الانظمه ، الأجسام المضادة الخاصة السومو هي الكواشف المفضلة للكشف والعزل والتحليلات الوظيفية للبروتينات المعدلة السومو8،9. ومع ذلك ، فان بعض الأجسام المضادة الخاصة بالسومو المتاحة تجاريا باهظه التكلفة ، ومحدوده الكمية أو التوافر ، وعرضه لإظهار التقارب المتغير بشكل عشوائي والتفاعل التبادلي ، وفي بعض الحالات تنقص استنساخ10. ويتمثل أحد النهج البديلة في التعبير عن العلامات التي تم الوسم بها في الخلايا المتحولة والكائنات الحية ، ولكن ربط علامات المربه إلى السومو قد يخفض بشكل مصطنع اقترانه بأهداف البروتين11. بالاضافه إلى ذلك ، لا تكون المربية مفيده عند تقييم الخلايا أو الانسجه غير المحولة.
Ulp1 هو الانزيم البروتيني السومو المحفوظة من s. سيريفيسياي ان كلا العمليات السلائف السومو و desumoylates السومو البروتينات مترافق12. قمنا بتطوير كاشف UTAG استنادا إلى الملاحظة صدفه ان طفرة من السيستين الحفاز (C580S) في Ulp1’s السومو معالجه Ulp domain (UD) لا يمنع فقط السومو الانقسام ولكن أيضا الفخاخ السومو-البروتينات مترافق مع ارتفاع الغرائب12. للبساطة ، أشرنا إلى هذه القطعة الطرفية Ulp1 (C580S) الخاصة بالجهاز الذي يشبه الكربوكسي باسم UTAG (اختصار ل UD TAG). UTAG هو بروتين التراكب عموم السومو التي تمثل بديلا مفيدا لمكافحه السومو الأجسام المضادة المستخدمة للعزل والكشف عن البروتينات المعدلة السومو. الأهم من ذلك ، فانه يعترف علي وجه التحديد-مطوية أصلا ، السومو مترافق وليس فقط واحد أو عده المردة علي السومو. لتحسين كل من الاستقرار البروتين و السومو قوه ملزمه من UTAG ، ونحن ولدت البديل من UTAG من الخميرة المتسامحة الإجهاد كلوفيريميسسيس ماركسيانوس (كم). KmUTAG باحكام يربط السومو-الاقتران مع نانومولار تقارب13. بالاضافه إلى ذلك ، kmUTAG مقاومه لدرجات الحرارة المرتفعة (42 درجه مئوية) ، والحد من العوامل (5 مم TCEP-تريس (2-كربوكسيايثيل) هيدروكلوريد فوسفونين) ، المسخ (ما يصل إلى 2 م اليوريا) ، والعوامل المؤكسدة (0.6 ٪ بيروكسيد الهيدروجين) ، والمنظفات غير الايونيه. هذا التحمل الإجهاد مفيد خلال حاله تنقيه قاسيه وأوقات الحضانة لفترات طويلة ، وضمان الاستقرار والنشاط السومو المحاصرة. ومع ذلك ، ليس من المستغرب ان يكون نشاط KmUTAG لمحاصره السومو غير متوافق مع الكواشف المعدلة من السيستين والمنظفات الايونيه ومستخلصات البروتين المشوهة تماما. التقارب الملحوظ وخصائص KmUTAG تشير إلى ان هذا الكاشف قد تصبح جزءا من المرجع القياسي لدراسة البروتينات sumoylated في أنواع متعددة.
هنا نقدم طريقه بسيطه للكشف عن البروتينات المعدلة السومو في الخلايا الثديية والديدان الخيطية باستخدام بروتين الانصهار الفلورية mCherry-كموتاغ المؤتلف (kmUTAG-fl).
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم استخدام kmUTAG-fl ، بروتين المؤتلف ، للدراسات الوظيفية من السومو في خلايا الثدييات الثابتة وتشريح الغدد الديدان الخيطية. KmUTAG-fl هو كاشف خاص بعموم السومو متسامح مع الإجهاد يتعرف علي البروتينات الاصليه المترافقة مع السومو وسلاسل السومو ويوقعها. وبما ان الهيكل الثالث لشركه السومو مصان ب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود ان نشكر جميع أعضاء مختبر كيرشر علي دعمهم ، ناتالي نغوين للقراءة النقدية للمخطوطة ، وليديا سيب للتسلسل. وقد دعم هذا العمل صندوق الكومنولث لتسويق البحوث MF16-034-LS إلى OK. وقدم الدعم البحثي لطلاب W & M من قبل صندوق بحوث بيلي-هوستون ، ومركز تشارلز يكرم زمالات لري و CH.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
- Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
- Kerscher, O. . SUMOylation. , 1-11 (2016).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).
- Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
- Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
- Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
- Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).
- Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
- Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
- Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
- Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).
- Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
- Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).
- Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
- Ruckman, J., et al. 2′-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
- Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).
- Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).
- Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
- Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).
