蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化
Summary
相撲は必須で高度に保存された、小さなユビキチンのような修飾タンパク質です。このプロトコルでは、ストレス耐性組換え相撲捕捉タンパク質 (kmUTAG) を使用して、ネイティブ、タグなしの相撲コンジュゲート、およびさまざまな種類の細胞での局在を可視化することを説明しています。
Abstract
ここでは、哺乳動物細胞および線虫卵細胞におけるタンパク質およびそのサブ細胞局在の sumoylation を研究する新規な方法を提示している。この方法は、組換え改変された相撲捕集タンパク質断片を利用し、kmUTAG は、ストレス耐性出芽酵母Kluyveromyces marxianusの Ulp1 相撲プロテアーゼに由来する。我々は、抗体を使用せずに様々なモデルシステムで sumoylation を研究する目的で、kmUTAG の特性を適応してきた。相撲の研究のために、KmUTAG は抗体ベースのアプローチと比較するといくつかの利点があります。このストレス耐性の相撲捕集試薬は、組換えに生産され、多くの種から天然の相撲アイソフォームを認識し、かつ市販の抗体とは異なり、自由で非抱合型相撲に対する親和性の低下を示す。ここに示された代表的な結果は、哺乳動物組織培養細胞および線虫卵子における相撲コンジュゲートの局在を含む。
Introduction
この方法の目的は、組換え相撲捕獲 UTAG (ULp ドメインタグ) タンパク質を用いて、相撲共役タンパク質の研究と分析を容易にすることである。以下に詳述するように、UTAG は、他の試薬の代わりに、相撲修飾タンパク質を精製、検出、および視覚化するためのアプローチを使用することができます。成長条件に応じて、細胞は、相撲または相撲の鎖で修飾された数百または数千のタンパク質を含むことができる (レビューのために Kerscher et al. 20061および Kerscher 20162を参照)。これは、特に特定の sumoylation の標的の一部分のみが実際に改変された3であるため、特定の相撲修飾タンパク質の機能解析にとってかなりの困難を表している。転写調節、タンパク質の恒常性、細胞ストレスへの反応、有糸分裂と減数分裂の間のクロマチンのリモデリングなどの重要な細胞プロセスにおけるそれらの役割に加えて、;現在では、相撲、相撲改変タンパク質、および相撲の経路構成要素も、癌や神経変性疾患などの病理のためのバイオマーカーとして可能性があることが十分に明らかになっています4,5,6 、7。これは、さまざまな細胞およびサンプルにおける相撲修飾タンパク質の検出と機能解析のための、堅牢で信頼性が高く、入手しやすいツールと革新的なアプローチの必要性を強調しています。
多くのシステムにおいて、相撲特異的抗体は、相撲修飾タンパク質8,9の検出、分離および機能分析のための選択の試薬です。しかしながら、いくつかの商業的に入手可能な相撲特異的抗体は、高価であり、量または可用性において制限され、乱暴に可変親和性および交差反応性を示す傾向があり、そしていくつかの例では再現性10を欠く。別のアプローチとしては、形質転換された細胞や生物におけるエピトープタグ付き相撲の発現があるが、エピトープタグを相撲に結びつけることは、タンパク質標的11への共役を人為的に下げる可能性がある。さらに、エピトープは、未変換の細胞または組織が評価される場合には有用ではない。
Ulp1 は、相撲前駆体と desumoylates 相撲共役タンパク質12の両方を処理するs. セレビシエから保存された相撲プロテアーゼである。UTAG 試薬は、Ulp1’s 相撲加工における触媒性システイン (C580S) の変異が相撲の切断を防ぐだけでなく、相撲共役タンパク質を高いものとして偶然という観測に基づいて開発されました。アビディティ12.簡単にするために、我々は、UTAG (UD タグの略) として、このカルボキシ末端末端相撲トラッピング Ulp1 (C580S) 断片を言及しました。UTAG は、相撲修飾タンパク質の単離と検出に使用される、抗相撲抗体の有用な代替手段を表す組換え汎相撲の捕捉タンパク質である。重要なことに、それは具体的には、相撲の1つまたは複数のエピトープだけでなく、ネイティブに折り畳まれた相撲を認識しています。UTAG のタンパク質安定性と相撲の結合強度の両方を向上させるために、ストレス耐性酵母Kluyveromyces marxianus (Km) から UTAG の変種を生成した。KmUTAG は、相撲-コンジュゲートをナノモルアフィニティ13と緊密に結合します。さらに、kmUTAG は、高温 (42 ° c)、還元剤 (5 mM TCEP-トリス (2-carboxyethyl) 塩酸ホスフィン)、denaturants (最大 2 M 尿素)、酸化剤 (0.6% 過酸化水素)、および非イオン性洗剤に対して耐性があります。このストレス耐性は、過酷な浄化条件と長時間のインキュベーション時間の間に有益であり、その安定性と相撲捕獲活性を保証します。しかし、KmUTAG の相撲捕獲活動は、システイン修飾試薬やイオン性洗剤、完全に変性したタンパク質抽出物とは互換性がありません。KmUTAG の顕著な親和性および特性は、この試薬が複数の種に sumoylated タンパク質の研究のための標準的なレパートリーの一部となる可能性があることを示す。
ここでは、組換え蛍光 mCherry-KmUTAG 融合タンパク質 (kmUTAG) を使用して、哺乳動物細胞および線虫における相撲修飾タンパク質を検出する簡単な方法を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、固定された哺乳動物細胞における相撲の機能研究のための組み換えタンパク質である kmUTAG の使用について紹介し、線虫生殖腺を解剖した。KmUTAG は、相撲をコンジュゲートしたタンパク質と相撲チェーンを認識し、トラップするストレス耐性の pan 相撲特異的試薬です。相撲の三次構造が高度に保存されているため、追加モデルや非モデル系からの相撲の変種を kmUTAG 試薬で分析で…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は彼らのサポートのために Kerscher ラボのすべてのメンバーに感謝したい, 原稿の批判的な読書のためのナタリー・グエン, シーケンシングのためのリディア Epp.この作品は、コモンウェルス研究商業化ファンド MF16-034-LS に支持されています。W & M 学生の研究支援は、ベイリー・ヒューストン研究基金によって提供され、チャールズ・センターは RY と CH にフェローシップを表彰した。
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
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