Локализация сумо-модифицированных белков с использованием флуоресцентного сумо-улавливания белков
Summary
Сумо является важным и очень консервативны, Малый убиквитин-как модификатор белка. В этом протоколе мы описываем использование устойчивых к стрессу рекомбинантного белка-улавливания сумо (kmUTAG) для визуализации родных, незамаркированных спрятаных концентов сумо и их локализации в различных типах клеток.
Abstract
Здесь мы представляем новый метод изучения фосфорилировании белков и их суб-клеточной локализации в клетках млекопитающих и не, ооцитов. Этот метод использует рекомбинантные изменения сумо захвата белка фрагмент, kmUTAG, производные от Ulp1 сумо протеазы стресс-терпимой многообещающий дрожжей Клюйверомика marxianus. Мы адаптировали свойства kmUTAG с целью изучения сумоилирования в различных модельных системах без применения антител. Для изучения сумо, KmUTAG имеет несколько преимуществ по сравнению с антителами на основе подходов. Этот стресс-терпимый сумо-захвата реагента производится рекомбинантли, он признает родной сумо изоформы от многих видов, и в отличие от коммерчески доступных антител он показывает снижение сродство для свободного, неприпрянепрямой сумо. Репрезентативные результаты, показанные здесь, включают локализацию контургейтов сумо в клетках культуры млекопитающих и немелях ооцитов.
Introduction
Цель этого метода состоит в том, чтобы облегчить изучение и анализ белков сумо-спряга с использованием рекомбинантной белки, удерживающей захват сумо UTAG (ULP доменного тега). Как описано ниже, UTAG может использоваться вместо других реагентов и подходов для очищения, обнаружения и визуализации сумо-модифицированных белков. В зависимости от условий роста, клетки могут содержать сотни или тысячи белков, которые модифицированы с сумо или сумо цепей (для обзора см. Kerscher et al. 20061 и кершер 20162). Это представляет значительные трудности для функционального анализа конкретных сумо-модифицированных белков, тем более, что только часть конкретной цели фосфорилировании фактически изменены3. В дополнение к их роли в основных клеточных процессов, таких как транскрипционного регулирования, белка гомеостаза, ответ на клеточный стресс, и хроматина ремоделирования во время митоза и мейоз; Теперь стало достаточно ясно, что сумо, сумо-модифицированных белков и компонентов сумо пути также имеют потенциал в качестве биомаркеров для патологий, таких как рак и нейродегенеративных расстройств4,5,6 ,7. Это подчеркивает необходимость надежных, надежных и легко доступных инструментов и инновационных подходов для обнаружения и функционального анализа сумо-модифицированных белков в различных клетках и образцах.
Во многих системах антитела, специфическая для сумо, являются реагентами выбора для обнаружения, изоляции и функционального анализа сумо-модифицированных белков8,9. Однако, некоторые коммерчески доступные сумо-специфические антитела дорогие, ограниченные по количеству или доступности, склонные выставлять дико переменные сходства и перекрестную реактивность, и в некоторых случаях отсутствие воспроизводимости10. Одним из альтернативных подходов является выражение эпитопа-тегами сумо в трансформированных клетках и организмах, но связывая Теги эпитопа к сумо может искусственно понизить его сопряжение с целями протеина11. Кроме того, эпитопы не полезны при оценке нетрансформиенных клеток или тканей.
Ulp1 является консервативным протеазы сумо из с. цервиии, что оба процесса прекурсоров сумо и desumoylates сумо-спрягается белки12. Мы разработали реагента UTAG на основе счастливого наблюдения, что мутация каталитического цистеина (C580S) в Ulp1’s сумо ULP domain (UD) не только предотвращает расщепление сумо, но и ловушки сумо-спрягается белков с высоким Жадность12. Для простоты, мы ссылались на этот карквадратные терминала сумо Ulp1 (C580S) фрагмент как UTAG (короткий для UD TAG). UTAG является рекомбинантной Пан-сумо улавливания белка, который представляет собой полезную альтернативу анти-сумо антител, используемых для изоляции и обнаружение сумо-модифицированных белков. Важно отметить, что он специально признает, изначально сложенный, спрягается сумо, а не только один или несколько эпитопов на сумо. Для улучшения как белка стабильности и силы сумо связывания UTAG, мы породили вариант UTAG из стрессоустойчивых дрожжей Клюйверомика marxianus (km). KmUTAG плотно связывает сумо-спрятаврат с наносолнечной сродство13. Кроме того, kmUTAG устойчив к повышенным температурам (42 ° с), уменьшающих агенты (5 мм ТВИС-РИЦ (2-карбокезил) фосфин гидрохлорид), денатуранты (до 2 м мочевины), окисляющие вещества (0,6% перекиси водорода) и неионные моющие средства. Этот стресс терпимости выгодно во время суровых условиях очистки и длительное время инкубации, обеспечивая его стабильность и сумо-захвата деятельности. Не удивительно, однако, KmUTAG в сумо-захвата деятельность несовместима с цистеин-модификации реагентов, ионные моющие средства и полностью денатурированного белка экстрактов. Замечательное сходство и свойства KmUTAG показывают, что этот реагент может стать частью стандартного репертуара для исследования sumoylated белков в нескольких видов.
Здесь мы предоставляем простой метод для обнаружения сумо-модифицированных белков в клетках млекопитающих и нематод с использованием рекомбинантного флуоресцентный белок-KmUTAG Fusion белка (kmUTAG-FL).
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы вводим использование kmUTAG-FL, рекомбинантного белка, для функциональных исследований сумо в стационарных клетках млекопитающих и расчлененных гомелях. KmUTAG-FL является стресс-терпимым Пан-сумо конкретных реагентов, что признает и ловушки родной сумо-спрятаных белков и сумо цепей…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Кершера за их поддержку, Натали Нгуен для критического чтения рукописи, и Лидия ЭПР для секвенирования. Эта работа была поддержана Фондом коммерциализации исследований Содружества MF16-034-LS в OK. Исследовательская поддержка для студентов W & M была предоставлена Фондом научных исследований Бейли-Хьюстон, а Карлов центр чтит стипендии RY и CH.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
- Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
- Kerscher, O. . SUMOylation. , 1-11 (2016).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).
- Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
- Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
- Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
- Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).
- Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
- Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
- Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
- Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).
- Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
- Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).
- Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
- Ruckman, J., et al. 2′-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
- Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).
- Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).
- Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
- Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).
