Localización de proteínas de SUMO modificado utilizando proteínas de atrapamiento de sumo fluorescente
Summary
El SUMO es una proteína modificadora de ubiquitina, esencial y muy conservada. En este protocolo Describimos el uso de una proteína de captura de SUMO recombinante con tolerancia al estrés (kmUTAG) para visualizar conjugados de SUMO nativos, sin etiquetar y su localización en una variedad de tipos de células.
Abstract
Aquí presentamos un método novedoso para estudiar la sumoyación de las proteínas y su localización subcelular en las células de mamíferos y los nematodos ovocitos. Este método utiliza un fragmento de proteína de captura de SUMO modificado recombinante, kmUTAG, derivado de la proteasa de SUMO Ulp1 de la levadura en ciernes tolerante al estrés Kluyveromyces marxianus. Hemos adaptado las propiedades del kmUTAG con el fin de estudiar la sumoyación en una variedad de sistemas modelo sin el uso de anticuerpos. Para el estudio de SUMO, KmUTAG tiene varias ventajas en comparación con los enfoques basados en anticuerpos. Este reactivo de captura de SUMO tolerante al estrés se produce de forma recombinante, reconoce isoformas de SUMO nativos de muchas especies y, a diferencia de los anticuerpos disponibles comercialmente, muestra una afinidad reducida para el SUMO libre y no conjugada. Los resultados representativos que se muestran aquí incluyen la localización de los conjugados de sumo en las células de cultivo de tejidos de mamíferos y los nematodos ovocitos.
Introduction
El propósito de este método es facilitar el estudio y análisis de las proteínas conjugadas por el SUMO usando la proteína UTAG ( etiquetade dominioULP) recombinante de sumo-atrapante. Como se detalla a continuación, UTAG se puede utilizar en lugar de otros reactivos y enfoques para purificar, detectar y visualizar las proteínas de SUMO modificado. Dependiendo de las condiciones de crecimiento, las células pueden contener cientos o miles de proteínas que se modifican con las cadenas SUMO o SUMO (para revisión ver Kerscher et al. 20061 y kerscher 20162). Esto representa una dificultad considerable para los análisis funcionales de proteínas específicas de SUMO modificado, especialmente porque sólo una fracción de un objetivo de sumoyación en particular se modifica realmente3. Además de sus funciones en procesos celulares esenciales como la regulación transcripcional, la homeostasis proteica, la respuesta al estrés celular, y la remodelación de la cromatina durante la la mitosis y la meiosis; ahora se ha vuelto suficientemente claro que el sumo, las proteínas modificadas por el sumo y los componentes de la vía de sumo también tienen potencial como biomarcadores para patologías como el cáncer y los trastornos neurodegenerativos4,5,6 ,7. Esto subraya la necesidad de herramientas sólidas, fiables y fácilmente disponibles y enfoques innovadores para la detección y el análisis funcional de las proteínas de SUMO modificado en una variedad de células y muestras.
En muchos sistemas, los anticuerpos específicos de sumo son los reactivos de elección para la detección, el aislamiento y los análisis funcionales de las proteínas de sumo modificado8,9. Sin embargo, algunos anticuerpos específicos de SUMO disponibles comercialmente son caros, limitados en cantidad o disponibilidad, propensos a exhibir afinidades extremadamente variables y reactividad cruzada, y en algunos casos carecen de reproducibilidad10. Un enfoque alternativo es la expresión de SUMO con etiqueta epitópica en células y organismos transformados, pero vincular las etiquetas epítopos a SUMO puede reducir artificialmente su conjugación a los objetivos proteicos11. Además, los epítopos no son útiles cuando se evalúan las células o los tejidos no transformados.
Ulp1 es una proteasa SUMO conservada de S. cerevisiae que procesa el precursor de sumo y desumolates proteínas conjugadas de sumo12. Desarrollamos el reactivo de utag basado en la observación fortuítica de que una mutación de la cisteina cisteína (C580S) en Ulp1’s sumo procesamiento ULP dcrear (Ud) no sólo previene el escote de sumo sino que también atrapa las proteínas conjugadas del sumo con altos avidez12. Para simplificar, nos hemos referido a este fragmento de Ulp1 (C580S) carboxy-terminal que atrapa el SUMO como UTAG (abreviatura de UD TAG). UTAG es una proteína de reventado de pan-SUMO recombinante que representa una alternativa útil a los anticuerpos anti-SUMO utilizados para el aislamiento y la detección de proteínas de SUMO modificado. Es importante destacar que reconoce específicamente el SUMO conjugada, doblado de forma nativa y no solo uno o varios epítopos en SUMO. Para mejorar tanto la estabilidad proteica como la fuerza de unión de SUMO de UTAG, generamos una variante de UTAG de la levadura tolerante al estrés Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG une estrechamente conjugados de SUMO con afinidad nanomolares13. Adicionalmente, kmUTAG es resistente a temperaturas elevadas (42 ° c), agentes reductores (5 mM TCEP-Tris (2-carboxietil) clorhidrato de fosfina), desnaturants (hasta 2 M de urea), agentes oxidantes (0,6% peróxido de hidrógeno), y detergentes no iónicos. Esta tolerancia al estrés es beneficiosa durante condiciones de purificación duras y tiempos de incubación prolongados, asegurando su estabilidad y la actividad de captura de SUMO. Sin embargo, no es de extrañar que la actividad de captura de SUMO de KmUTAG sea incompatible con los reactivos modificadores de la cisteína, los detergentes iónicos y los extractos proteicos completamente desnaturalizadas. La notable afinidad y propiedades de KmUTAG indican que este reactivo puede formar parte del repertorio estándar para el estudio de proteínas sumoiladas en múltiples especies.
Aquí proporcionamos un método simple para detectar proteínas de SUMO modificado en células de mamíferos y nematodos utilizando una proteína de fusión mCherry-KmUTAG fluorescente recombinante (kmUTAG-FL).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí presentamos el uso de kmutag-FL, una proteína recombinante, para estudios funcionales de sumo en células de mamífero fijas y gónadas de nematodos disecado. KmUTAG-FL es un reactivo específico de pan-SUMO tolerante al estrés que reconoce y atrapa las proteínas conjugadas y las cadenas de SUMO nativas del SUMO. Dado que la estructura terciaria de SUMO está muy conservada, es muy probable que las variantes de SUMO de los sistemas adicionales de modelo y no modelo puedan analizarse con el reactivo kmUTAG-FL. Co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a todos los miembros del laboratorio Kerscher por su apoyo, Nathalie Nguyen para la lectura crítica del manuscrito, y Lidia EPP para la secuenciación. Este trabajo ha sido apoyado por el fondo de comercialización de investigación de la Commonwealth MF16-034-LS a OK. El apoyo a la investigación para los estudiantes de W & M fue proporcionado por el fondo de investigación Bailey-Huston, y el Charles Center Honors becas a RY y CH.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
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