Localização de proteínas SUMO-modificadas usando proteínas de captura de sumo fluorescentes
Summary
SUMO é um essencial e altamente conservado, pequena ubiquitina-like modificador de proteína. Neste protocolo nós estamos descrevendo o uso de uma proteína de SUMO-aprisionamento recombinante stress-tolerante (kmUTAG) para visualizar os conjugados nativos, Untagged de SUMO e sua localização em uma variedade de tipos da pilha.
Abstract
Aqui nós estamos apresentando um método novo estudar a sumoilação das proteínas e sua localização Subcellular em pilhas de mamíferos e em oocytes do nematóide. Este método utiliza um fragmento de proteína de SUMO-aprisionamento modificado recombinante, kmUTAG, derivado do Ulp1 SUMO protease da levedura de brotamento tolerante ao estresse Kluyveromyces marxianus. Nós adaptamos as propriedades do kmutag com a finalidade de estudar a sumoilação em uma variedade de sistemas modelo sem o uso dos anticorpos. Para o estudo de SUMO, KmUTAG tem várias vantagens quando comparada com abordagens baseadas em anticorpos. Este reagente stress-tolerante do SUMO-aprisionamento é produzido recombinantly, reconhece isoformas de SUMO nativos de muitas espécies, e ao contrário dos anticorpos comercialmente disponíveis mostra a afinidade reduzida para o SUMO livre, Unconjugated. Os resultados representativos mostrados aqui incluem a localização de conjugados de sumo em pilhas da cultura de mamíferos do tecido e em oocytes do nematóide.
Introduction
A finalidade deste método é facilitar o estudo e a análise de proteínas SUMO-conjugadas usando a proteína recombinante de SUMO-trapping UTAG ( etiquetado domínio deULP). Como detalhado abaixo, UTAG pode ser usado no lugar de outros reagentes e aproximações para purify, detecta, e visualiza proteínas SUMO-modificadas. Dependendo das condições de crescimento, as células podem conter centenas ou milhares de proteínas que são modificadas com cadeias sumô ou SUMO (para revisão ver Kerscher et al. 2006 e kerscher 20162). Isto representa uma dificuldade considerável para as análises funcionais de proteínas de sumo-modificadas específicas, especialmente porque somente uma fração de um alvo particular da sumoilação é modificada realmente3. Além de seus papéis em processos celulares essenciais, tais como regulação transcricional, homeostase protéica, a resposta ao estresse celular, e remodelação da cromatina durante a mitose e meiose; tornou-se agora suficientemente desobstruído que o sumo, as proteínas sumo-modificadas, e os componentes do caminho do sumo igualmente têm o potencial como biomarcadores para patologias tais como o cancro e desordens neurodegenerativas4,5,6 ,7. Isso ressalta a necessidade de ferramentas robustas, confiáveis e prontamente disponíveis e abordagens inovadoras para a detecção e análise funcional de proteínas SUMO-modificadas em uma variedade de células e amostras.
Em muitos sistemas, os anticorpos de sumo-específicos são os reagentes da escolha para a deteção, a isolação e as análises funcionais deproteínas sumo-modificadas8,9. Entretanto, alguns anticorpos sumô-específicos comercialmente disponíveis são caros, limitados em quantidade ou disponibilidade, propensos a expor afinidades e reatividade cruzada de forma descontroladamente variável e, em alguns casos, falta de reprodutibilidade10. Uma abordagem alternativa é a expressão do epítopo mapeado-Tagged sumo em células transformadas e organismos, mas ligando epítopo Tags para sumo pode artificialmente diminuir a sua conjugação de alvos de proteínas11. Adicionalmente, os epítopos não são úteis quando as células ou tecidos não transformados são avaliados.
Ulp1 é uma protease de SUMO conservada de S. cerevisiae que processa o precursor de sumo e desumoylates proteínas CONJUGADAS com sumo-12. Nós desenvolvemos o reagente de utag baseado na observação serendipitous que uma mutação da cisteína catalítica (C580S) em Ulp1’s sumo que processa ULP domínio (UD) não somente impede a segmentação de sumô mas igualmente prende proteínas sumo-conjugadas com a elevação avidez12. Para simplificar, nós nos referimos a este fragmento carboxy-terminal SUMO-aprisionamento Ulp1 (C580S) como UTAG (abreviada para UD TAG). UTAG é uma proteína de aprisionamento de Pan-SUMO recombinante que representa uma alternativa útil aos anticorpos anti-SUMO utilizados para o isolamento e detecção de proteínas SUMO-modificadas. Importante, ele especificamente reconhece nativamente dobrado, conjugada sumo e não apenas um ou vários epítopos no sumo. Para melhorar a estabilidade da proteína e a força obrigatória de SUMO de UTAG, nós geramos uma variação de UTAG do fermento stress-tolerante Kluyveromyces marxianus (quilômetro). A KmUTAG liga firmemente os conjugados sumô com a afinidade nanomolares13. Adicionalmente, kmUTAG é resistente a temperaturas elevadas (42 ° c), agentes redutores (5 mM TCEP-tris (2-carboxietil) cloridrato de fosfina), desnaturantes (até 2 M de ureia), agentes oxidantes (0,6% de peróxido de hidrogênio) e detergentes não iônicos. Esta tolerância ao stress é benéfica durante a condição de purificação dura e tempos de incubação prolongados, assegurando a sua estabilidade e atividade de captura de sumô. Não surpreendentemente, no entanto, a atividade do KmUTAG SUMO-trapping é incompatível com reagentes modificadores da cisteína, detergentes iônicos e extratos proteicos totalmente desnaturados. A afinidade e as propriedades notáveis de KmUTAG indicam que este reagente pode se tornar parte do repertório padrão para o estudo de proteínas sumoylated em espécies múltiplas.
Aqui nós fornecemos um método simples para detectar proteínas sumo-modificadas em pilhas de mamíferos e nematóides usando uma proteína de fusão fluorescente mcherry-kmutag de recombinação (kmutag-FL).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui apresentamos o uso de kmUTAG-FL, uma proteína recombinante, para estudos funcionais de SUMO em células de mamíferos fixas e gônadas de nematódeos dissecados. O KmUTAG-FL é um reagente específico de Pan-SUMO, tolerante ao stress, que reconhece e intercepta proteínas conjugadas de SUMO nativas e cadeias de SUMO. Desde que a estrutura terciária de sumô é altamente conservada é muito provável que as variações de sumô do modelo adicional e dos sistemas do não-modelo possam ser analisadas com o reagente d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório Kerscher por seu apoio, Nathalie Nguyen para a leitura crítica do manuscrito, e Lidia EPP para seqüenciamento. Este trabalho tem sido apoiado pelo Commonwealth Research comercialização fundo MF16-034-LS para OK. O apoio à pesquisa para estudantes de W & M foi fornecido pelo fundo de pesquisa Bailey-Huston, e Charles Center Honors bolsas para RY e CH.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
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