Coleta de sangue por punção da veia subclávia em camundongos
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para tirar amostras de sangue da veia subclávia de camundongos.
Abstract
O rato é o principal modelo de mamíferos para estudar doenças humanas e saúde humana. No entanto, coleta de amostras de sangue de camundongos é desafiador no trabalho de pesquisa. A coleta de sangue da cauda é um método popular quando uma pequena quantidade de amostra de sangue é necessária. Artéria orbital pode ser considerada se uma grande quantidade de sangue é necessária, mas este método de coleta de sangue tem problemas éticos. Anteriormente, demonstramos a viabilidade e segurança da coleta de amostras de sangue por punção da veia subclávia em ratos, e aqui investigamos se esse método pode ser utilizado em camundongos. Nós relatamos que este método é seguro e prático para a coleção do sangue nos ratos. A coleta de sangue através da punção da veia subclávia em camundongos pode ser um método conveniente em trabalhos de pesquisa diários.
Introduction
Coleta de amostras de sangue de camundongos é essencial na maioria dos laboratórios de pesquisa. As abordagens convencionais para coleta de sangue em camundongos são o corte da cauda quando menos de 100 μL de amostra é necessária1. No entanto, se mais de 100 μL de sangue forem exigidos em um ponto de tempo não terminal, o sangramento retroorbital, submandibular ou a coleta de sangue submental são as técnicas mais comumente consideradas2. Em algumas ocasiões, o cateterismo da veia jugular por meio de incisão cirúrgica foi adotado como método alternativo3.
No entanto, os métodos acima são prejudiciais para os camundongos. Ao melhor de nosso conhecimento, o método retroorbital não é amplamente aceito por causa do risco potencial de complicações4,5. O trauma relacionado à operação não só acontece na área visível6,7, mas também no fundo da órbita6. Além disso, a coleta de sangue submandibular é estressante8 e pode estarassociada a sangramento excessivo1,9. Com base em nossa pesquisa anterior10,11, apresentamos aqui uma nova estratégia para coleta de sangue a partir da veia subclávia em camundongos. A segurança, a viabilidade, e o volume sanguíneo obtido com esta técnica são apresentados e discutidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este relato representa uma extensão da pesquisa prévia sobre a amostragem de sangue através da punção da veia subclávia em ratos11. Como o mouse é o animal de pesquisa mais comumente usado, seria valioso para ver se esta técnica também pode ser aplicada a camundongos. O desafio vem do diâmetro relativamente menor da veia subclávia.
Na presente pesquisa, verificou-se que a punção subclávia em camundongos é uma forma viável e confiável de coletar sangue. Em comparação com os métodos convencionais, como o corte da veia da cauda ou a coleta de sangue orbital, não há questões éticas do presente método. Todos os animais sobreviveram após este procedimento sem suplementos líquidos após cerca de 200 μL de extração de sangue, e os animais podiam ser usados para estudos experimentais posteriores. Teoricamente, a extração total do volume amostral não pôde atingir mais de 10% do volume sanguíneo circulante total de cada vez e o volume total de um animal adulto é de 55 a 70 mL/kg de peso corporal5. Para os camundongos utilizados nesta pesquisa (21,6-28,3 g), a extração do volume máximo deve ser de cerca de 200 μL. Assim, definimos a quantidade de amostragem de sangue em torno de 200 μL para cada rato. A incapacidade de medir a pressão arterial, frequência cardíaca e outros parâmetros de estresse são as principais limitações deste relatório.
Anestesia geral suficiente é outra questão importante para garantir o sucesso da punção. Os camundongos devem permanecer quietos durante o procedimento de punção para evitar o risco de ferir o vaso pela agulha. Nós encontramos que o sódio de pentobarbital em 60 MGS/quilograma para a anestesia geral poderia satisfazer a profundidade ideal da anestesia. Uma desvantagem deste agente é o tempo de recuperação relativamente longo (média de cerca de 30 minutos). Em alguns institutos, a inalação de isoflurano é utilizada para o curto tempo de recuperação e deve ser levada em consideração como escolha alternativa de anestesia15.
A localização da veia subclávia é mostrada na Figura 4. Por causa da parede fina e baixa pressão na veia, a parede anterior e posterior da veia subclávia se anexaria um ao outro a pressão de uma agulha, enquanto a agulha está se movendo para a frente (Figura 5a). Ao retirar o êmbolo lentamente para trás, as paredes anexadas se separarão espontaneamente, e a ponta da agulha pode entrar na verdadeira cavidade do vaso e o sangue pode drenar para a seringa pressão negativa sustentada (Figura 5b). O uso de um sistema de coleta de sangue a vácuo16 também pode favorecer a coleta de sangue. Devido ao diâmetro relativamente pequeno da veia subclávia dos ratos, pode haver falhas mesmo para um operador experiente. Para um novato, nós recomendamos a punctura da veia subclávia nos ratos como relatado11. Após várias tentativas de punção com sucesso em ratos, a taxa de sucesso da punção da veia subclávia em camundongos poderia ser significativamente melhorada. Certifique-se de que o local exato de punção é apenas caudal para o meio do osso da clavícula. A agulha que se move para cima e craniano para a fossa esternal superior são outros pontos-chave para garantir uma punção bem-sucedida.
Em conclusão, a punção da veia subclávia é um método seguro e efetivo para coleta de sangue em camundongos. Além do corte da veia da cauda e da coleta do sangue do plexo retro-orbital, este método é viável, seguro, e apropriado para pesquisas observacionais em diversos pontos do tempo nos ratos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela concessão da Fundação Nacional da ciência natural da China no. 81670269, no. 81500355 e no. 81500226.
Materials
| 1.0 mL syringe | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| 75% ethanol | Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University | made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity | |
| adhesive tape | 3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany) | 1534-1 | |
| canvas gloves | for anesthesia | ||
| electronic scale | Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China) | KP-3000 | |
| epilating agent | France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China) | 8281744 | |
| heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU) | Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China) | H32025851 | |
| mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) | Kunming spcies | |
| needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China) | 20163151593 | |
| pentobarbital sodium (used solution 1%) | Merck | P-010-1ML | |
| physiological saline, 100 mL | Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China) | H43020454 | |
| stastical software | International Business Machines | SPSS Statistics 25 | |
| tube, 2 mL | Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China) | MCT-150-C | |
References
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Regan, R. D., Fenyk-Melody, J. E., Tran, S. M., Chen, G., Stocking, K. L. Comparison of Submental Blood Collection with the Retroorbital and Submandibular Methods in Mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (5), 570-576 (2016).
- Park, A. Y., et al. Blood collection in unstressed, conscious, and freely moving mice through implantation of catheters in the jugular vein: a new simplified protocol. Physiological Reports. 6 (21), e13904 (2018).
- Heimann, M., Kasermann, H. P., Pfister, R., Roth, D. R., Burki, K. Blood collection from the sublingual vein in mice and hamsters: a suitable alternative to retrobulbar technique that provides large volumes and minimizes tissue damage. Laboratory Animals. 43 (3), 255-260 (2009).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- van Herck, H., et al. Orbital sinus blood sampling in rats as performed by different animal technicians: the influence of technique and expertise. Laboratory Animals. 32 (4), 377-386 (1998).
- Tsai, P. P., et al. Effects of different blood collection methods on indicators of welfare in mice. Lab Anim (NY). 44 (8), 301-310 (2015).
- Holmberg, H., Kiersgaard, M. K., Mikkelsen, L. F., Tranholm, M. Impact of blood sampling technique on blood quality and animal welfare in haemophilic mice. Laboratory Animals. 45 (2), 114-120 (2011).
- Yang, H., et al. Safety and efficacy of a modified axillary vein technique for pacemaker implantation. Cardiology Plus. 3, 104-107 (2018).
- Yang, H., et al. Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).
- Kilkenny, C., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: ARRIVE-ing at a solution. Laboratory Animals. 44 (4), 377-378 (2010).
- Research, I. f. L. A. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
- Redel, A., et al. Impact of ischemia and reperfusion times on myocardial infarct size in mice in vivo. Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.). 233 (1), 84-93 (2008).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
