Общесистемный анализ нескольких биомолекул имеет решающее значение для получения функционального и механистического понимания биологических процессов. Таким образом, описывается обширный протокол для высокой пропускной произвлечения липидов, метаболитов, белков и крахмала из одного образца, собранного из синхронной культуры chlamydomonas.
Микроводоросли были в центре исследований для их применения в производстве дорогостоящих соединений, продуктов питания и топлива. Кроме того, они являются ценными фотосинтетическими моделями, облегчающими понимание основных клеточных процессов. Системные широкие исследования позволяют всесторонне и углубленное понимание молекулярных функций организмов. Тем не менее, несколько независимых образцов и протоколов необходимы для протеомики, липидоми и метаболомики исследований, вводящих более высокую погрешность и изменчивость. Здесь представлен надежный метод экстракции с высокой пропускной стоимостью для одновременной экстракции хлорофилла, липидов, метаболитов, белков и крахмала из одного образца зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. Иллюстрированная экспериментальная установка предназначена для культур Chlamydomonas, синхронизированных с использованием 12 ч/12 ч световых/темных условий. Образцы были собраны в течение 24 h цикла клеток, чтобы продемонстрировать, что метаболиты, липиды и крахмал данных, полученных с помощью различных аналитических платформ хорошо соответствует. Кроме того, протеиновые образцы, собранные с использованием того же протокола экстракции, использовались для проведения детального анализа протеомики для оценки их качества и воспроизводимости. На основе полученных данных можно сделать вывод о том, что иллюстрированный метод обеспечивает надежный и воспроизводимый подход к более глубокому пониманию различных биохимических путей и их функций с большей уверенностью как в базовых, так и на прикладных исследованиях.
Микроводоросли являются богатым источником натуральных продуктов (например, топлива, питания человека и животных, косметики и фармакологических веществ). Проводятся многочисленные научно-исследовательские работы по повышению эффективностипроизводства продукции высокой стоимости из микроводорослей 1,2,3,4. Системное понимание метаболизма является предпосылкой для улучшения качества и урожайности натуральных продуктов5,6,7. С появлением функциональных геномных методов и усовершенствованных методов масс-спектрометрии одновременно можно контролировать тысячи генов, стенограмм, белков и метаболитов. Тем не менее, несколько образцов необходимы для углубленной протеомики, липидоми и метаболомики исследований, которые часто трудно достичь в одноклеточных организмов, особенно если время курс исследования должны быть выполнены. Кроме того, сбор и обработка различных выборочных аликвот в сочетании с различными протоколами для сбора весьма сложных омицических данных (т.е. протеомических, липидомных и метаболомик) вводит изменчивость, что делает интеграцию данных сложной задачей.
Chlamydomonas обеспечивает не только отличную микробную систему для исследования клеточных процессов, но и удобную модель для изучения координации клеточного цикла и метаболизма. Соответственно, сильная координация выражения транскриптов с клеточным циклом была показана с помощью транскриптома высокого разрешения, профилирующего синхронную культуру Chlamydomonas8. Около 80% проанализированных стенограмм продемонстрировали надежную периодичность втечение 24 ч клеточного цикла 8. Аналогичным образом, сухой вес, белки, хлорофилл, аминокислоты и жирные кислоты двух различных штаммов chlamydomonas было показано, коррелируют с делением клеток в исследовании, где отбор проб был выполнен каждые 4 ч9. Недавно сообщалось, что метаболит и липидная динамика клеточного сдвига основаны на конкретных фазах клеточного цикла10. Тонкие изменения в различных биомолекулах можно было контролировать с помощью надежного метил-терт-бутилового эфира (MTBE): метанол: метод извлечения на водной основе, который предлагает идеальную отправную точку для всестороннего многовариантного анализа10 , 11.
Представленный протокол направляет через воспроизводимую и эффективную стратегию10, для одновременной экстракции липидов, метаболитов, белков и крахмала из одного образца аликота, на время решена метаболомическая и липидомное исследование синхронно растущих культур Chlamydomonas. В дополнение к иллюстрированию надежных и воспроизводимых метаболических и липидомных данных10, здесь, качество протеомных образцов, полученных из того же гранулы также продемонстрировано.
В этой статье мы проиллюстрировали надежный и очень применимый протокол извлечения для комплексной липидоми, метаболомики, крахмала и протеомики анализа из одной гранулы из 10-15 х 106 клеток. Метод был успешно внедрен в нескольких исследованиях для широкого спектра клеток и тканей10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Здесь мы представили пошаговый конвейер для многоомичного анализа различных биомолекул из одного образца, собранного из культуры Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 mt).
Протокол обеспечивает надежный и воспроизводимый подход к обработке нескольких образцов одновременно, для анализа различных биомолекул. Вместе с тем необходимо принять ряд важных мер, с тем чтобы свести к минимуму технические различия. Во-первых, сбор клеток должен проводиться как можно быстрее при сохранении единых условий для всех собранных образцов для сохранения биологического состояния клеток. Хотя мы использовали центрифугирование для сбора клеток, альтернативные стратегии сбора урожая могут быть использованы для сбора образцов. Тем не менее, важно отметить, что различные стратегии уборки, как известно, влияют на метаболическое состояние клеток37 следовательно, последовательный подход к уборке должны быть использованы для всех экспериментальных образцов. Во-вторых, важно избегать высыхания верхней неполярной фазы, содержащей хлорофилл, так как это может влиять на уровни растворенного хлорофилла в растворителе, влияющих на коэффициент нормализации образцов. Наконец, следует позаботиться при удалении оставшейся полярной фазы, чтобы получить белок и крахмал гранулы, чтобы избежать нарушения гранулы, которые могут влиять на содержание крахмала и белка.
Тем самым представленный протокол экстракции предлагает несколько преимуществ для анализа данных с несколькими омиками. Помимо минимизации требуемого количества образцов аликвот, это также уменьшает различия между аналитическими результатами, полученными для различных биомолекул. Это позволяет прямо сравнивать результаты, полученные из первичных метаболитов, липидов и протеомных данных. Аналогичным образом, одновременная добыча нескольких сложных классов позволяет последовательно и единообразно стратегии нормализации различных наборов данных. Это особенно применимо, если нормализация трудно достичь с помощью сухого или свежего веса38 или номер ячейки.
Протокол может быть реализован для регулярного скрининга сложного биологического образца. Эти целостные метаболомические, липидомные и протеомные наборы данных могут предоставить исчерпывающую информацию о систематических изменениях в обмене веществ. Кроме того, данные, полученные в результате анализа протеомики, дают представление о количественных (изобилии) и качественных (модификациях) изменениях в белках по отношению к метаболитам. Таким образом, интеграция данных омики может выявить углубленную информацию об изменениях, вызванных генетическими или биотическими и/или абиотические возмущения биологической системы. Таким образом, выяснение молекулярных изменений конкретных метаболических путей или клеточных процессов. Аналогичным образом, эти высокопроизводительные данные могут позволить идентификацию целей для метаболической инженерии и уточнить или проверить прогнозы из генома масштаба метаболических моделей37,39.
The authors have nothing to disclose.
Мы очень благодарны Гудруну Вольтеру и Анне Михаэлису за отличную техническую помощь. Мы хотели бы поблагодарить всех сотрудников лаборатории Giavalisco за их помощь. Мы благодарны Обществу Макса Планка за финансирование исследований и FAPESP для стипендий L A Giraldi
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |