تحليل الجزيئات الحيوية المتعددة على نطاق المنظومة أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى وظيفية وميكانيكية في العمليات البيولوجية. بموجب هذا، يتم وصف بروتوكول واسع النطاق لاستخراج الإنتاجية العالية من الدهون والأيض والبروتينات والنشا من عينة واحدة تم حصادها من ثقافة الكلاميدوموناس المتزامنة.
وكانت الطحالب الدقيقة محور البحوث لتطبيقاتها في إنتاج المركبات عالية القيمة والغذاء والوقود. وعلاوة على ذلك، فهي نماذج قيمة للتركيب الضوئي تسهل فهم العمليات الخلوية الأساسية. تتيح الدراسات على نطاق المنظومة فهمًا شاملًا ومتعمقًا للوظائف الجزيئية للكائنات الحية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى عينات وبروتوكولات مستقلة متعددة لدراسات البروتيوميات والدهون والميتابولات التي تحدث خطأ أعلى وتباين. يتم عرض طريقة قوية عالية استخراج الإنتاجية لاستخراج الكلوروفيل في وقت واحد، والدهون، والأيض، والبروتينات والنشا من عينة واحدة من الألغا الأخضر Chlamydomonas reinhardtii هنا. الإعداد التجريبي المصور هو لثقافات Chlamydomonas متزامنة باستخدام 12 ساعة / 12 ساعة ضوء / الظروف المظلمة. تم جمع العينات على مدى دورة خلية 24 ساعة لإثبات أن الأيض والدهون وبيانات النشا التي تم الحصول عليها باستخدام منصات تحليلية مختلفة مطابقة بشكل جيد. وعلاوة على ذلك، استُخدمت عينات البروتين التي جُمعت باستخدام بروتوكول الاستخراج نفسه لإجراء تحليل مفصل للبروتيوميات لتقييم نوعيتها وقابليتها للاستنساخ. واستناداً إلى البيانات، يمكن استنتاج أن الطريقة المصورة توفر نهجاً قوياً واستنساخاً لتعزيز فهم مختلف المسارات البيوكيميائية ووظائفها بثقة أكبر في البحوث الأساسية والتطبيقية على حد سواء.
الطحالب الدقيقة هي مصدر غني للمنتجات الطبيعية (مثل الوقود والتغذية البشرية والحيوانية ومستحضرات التجميل والمواد الدوائية). يتم تنفيذ العديد من الجهود البحثية لتعزيز كفاءة إنتاجالمنتجات ذات القيمة العالية من الطحالب الدقيقة 1،2،3،4. فهم على مستوى النظم لعملية التمثيل الغذائي هو شرط مسبق لتحسيننوعية وغلة المنتجات الطبيعية 5،6،7. مع ظهور تقنيات الجينوم الوظيفية وتحسين أساليب قياس الطيف الكتلي، يمكن رصد الآلاف من الجينات والنصوص والبروتينات والأيض في وقت واحد. ومع ذلك، هناك حاجة إلى عينات متعددة لدراسات البروتيوميات المتعمقة، والدهون والبيانات، والتي غالبا ً ما يكون من الصعب تحقيقها في الكائنات أحادية الخلية، خاصة إذا كان من المقرر إجراء دراسات دورة زمنية. وعلاوة على ذلك، فإن جمع ومعالجة أنواع مختلفة من الأليكوتات المختلفة بالاقتران مع بروتوكولات مختلفة لجمع بيانات الأوميكس المعقدة للغاية (أي البروتيوميك، والدهون، والبيانات) يدخل في تباين، مما يجعل تكامل البيانات مهمة صعبة.
الكلاميدومونات يوفر ليس فقط نظام الميكروبية ممتازة للتحقيق في العمليات الخلوية، ولكن أيضا نموذجا مناسبا لدراسة تنسيق دورة الخلية والتمثيل الغذائي. وبناء على ذلك، تم عرض تنسيق قوي للتعبير النصوص مع دورة الخلية باستخدام التنميط النسخ عالية الدقة من الثقافة المتزامنة من Chlamydomonas8. حوالي 80٪ من النصوص التي تم تحليلها أظهرت دورية قوية على مدى دورة خلية 24 ساعة8. وبالمثل ، تبين أن الوزن الجاف ، والبروتينات ، والكلوروفيل ، والأحماض الأمينية والأحماض الدهنية من سلالات مختلفة من الكلاميدوماسونا ترتبط مع انقسام الخلايا في دراسة حيث تم إجراء أخذ العينات كل 4 ح9. في الآونة الأخيرة، أفيد أن ديناميات المستقلب والدهون من تحول الخلية على أساس مراحل محددة من دورة الخلية10. كانت التغيرات الدقيقة في الجزيئات الحيوية المختلفة ممكنة للرصد باستخدام ميثيل ثالثبوتيل الأثير القوي (MTBE): الميثانول: طريقة الاستخراج القائمة على المياه، والتي توفر نقطة انطلاق مثالية لتحليل شامل متعدد الأوميكس10 , 11.
أدلة البروتوكول المقدمة من خلال استراتيجية قابلة للاستنساخ وفعالة10، لاستخراج في وقت واحد من الدهون ، والأيض ، والبروتينات والنشا من aliquot عينة واحدة ، للمرة حل دراسة الميتابوليوموميك والدهون من متزامن الثقافات الكلاميدوموناس المتنامية. بالإضافة إلى توضيح البيانات الأيضية والدهنية القوية والقابلة للاستنساخ10، هنا ، يتم أيضا ً إثبات جودة العينات البروتيومية التي تم الحصول عليها من نفس بيليه.
في هذه المقالة، قمنا بتوضيح بروتوكول استخراج قوي وقابل للتطبيق للغاية للدهون الشاملة، والبيانات ية، وتحليل النشا والبروتيوميات من بيليه واحد من 10-15 × 106 خلايا. وقد تم تنفيذ هذه الطريقة بنجاح في العديد من الدراسات لمجموعة واسعة من الخلايا والأنسجة10،14،21،22،23،24،25 ،26،27،28،29،30،31،32،33،34 ،35،36. هنا، قدمنا خط أنابيب خطوة لتحليل متعددة omics من الجزيئات الحيوية المختلفة من عينة واحدة تم حصادها من Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 mt+) الثقافة.
ويوفر البروتوكول نهجا قويا واستنساخا لمعالجة عينات متعددة في آن واحد، لتحليل مختلف الجزيئات الحيوية. ومع ذلك، ينبغي اتخاذ عدد من الخطوات الحاسمة من أجل التقليل إلى أدنى حد من التباين التقني. أولا، ينبغي أن يتم حصاد الخلايا في أسرع وقت ممكن مع الحفاظ على الظروف الموحدة لجميع العينات التي تم حصادها للحفاظ على الحالة البيولوجية للخلايا. على الرغم من أننا استخدمنا الطرد المركزي لحصاد الخلايا، يمكن استخدام استراتيجيات الحصاد البديلة لحصاد العينات. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن استراتيجيات الحصاد المختلفة من المعروف أن تؤثر على الحالة الأيضية للخلايا37 وبالتالي، يجب استخدام نهج الحصاد متسقة لجميع العينات التجريبية. ثانيا، من المهم تجنب تجفيف المرحلة العليا غير القطبية التي تحتوي على الكلوروفيل، لأن هذا يمكن أن يؤثر على مستويات الكلوروفيل المذاب في المذيب الذي يؤثر على عامل التطبيع للعينات. وأخيرا، ينبغي توخي الحذر أثناء إزالة المرحلة القطبية المتبقية للحصول على البروتين والنشا بيليه، لتجنب إزعاج بيليه التي يمكن أن تؤثر على محتوى النشا والبروتين.
وبالتالي يقدم بروتوكول الاستخراج المقدم عدة فوائد لتحليل البيانات متعددة omics. وإلى جانب تقليل عدد العوامل العلية المطلوبة، فإنه يقلل أيضا من التباين بين النتائج التحليلية التي تم الحصول عليها لمختلف الجزيئات الحيوية. وهذا يسمح بإجراء مقارنة مباشرة للنتائج التي تم الحصول عليها من الأيض الأولي والدهون والبيانات البروتيومية. وبالمثل، فإن الاستخراج المتزامن لفئات مركبة متعددة يسمح باستراتيجية تطبيع متسقة وموحدة لمجموعات البيانات المختلفة. وهذا ينطبق بشكل خاص إذا كان من الصعب تحقيق التطبيع باستخدام الوزن الجاف أو الطازج38 أو رقم الخلية.
ويمكن تنفيذ البروتوكول من أجل الفحص الروتيني لعينة بيولوجية معقدة. هذه المجموعات البيانات الميتابولوميك الكلي, الدهون وبروتيومميك يمكن أن توفر معلومات شاملة حول التغيرات المنهجية في عملية التمثيل الغذائي. بالإضافة إلى ذلك، فإن البيانات التي تم الحصول عليها من تحليل البروتيوميات، توفر رؤى في التغيرات الكمية (الوفرة) والنوعية (التعديلات) في البروتينات فيما يتعلق بالأيض. ومن ثم، فإن دمج البيانات الأوميسية يمكن أن يكشف عن معلومات متعمقة عن التغيرات الناجمة عن الاضطرابات الوراثية أو الأحيائية و/أو اللاأحيائية للنظام البيولوجي. وهكذا، توضيح التغيرات الجزيئية لمسارات التمثيل الغذائي محددة أو العمليات الخلوية. وبالمثل، فإن هذه البيانات عالية الإنتاجية يمكن أن تسمح بتحديد الأهداف للهندسة الأيضية وصقل أو اختبار التنبؤات من نماذج التمثيل الغذائي على نطاق الجينوم37،39.
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون جدا لغودرون ولتر ورين مايكليس على المساعدة التقنية الممتازة. ونود أن نشكر جميع أعضاء مختبر جيافاليسكو على مساعدتهم. نحن ممتنون لجمعية ماكس بلانك لتمويل البحوث وFAPESP لزمالة L A Giraldi
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |