A análise em todo o sistema de múltiplas biomoléculas é crucial para obter insights funcionais e mecanísticos em processos biológicos. Por este meio, um extenso protocolo é descrito para extração de alto débito de lipídios, metabólitos, proteínas e amido de uma única amostra colhida da cultura de Chlamydomonas sincronizada.
Microalgas têm sido o foco da pesquisa para suas aplicações na produção de compostos de alto valor, alimentos e combustíveis. Além disso, são modelos fotosintéticos valiosos facilitando a compreensão dos processos celulares básicos. Os estudos de sistema amplos permitem uma compreensão abrangente e aprofundada das funções moleculares dos organismos. No entanto, várias amostras e protocolos independentes são necessários para os estudos de proteômica, Shotgun e Metabolômica, apresentando maior erro e variabilidade. Um método robusto de extração de alta taxa de transferência para a extração simultânea de clorofila, lipídios, metabólitos, proteínas e amido de uma única amostra da alga verde Chlamydomonas reinhardtii é apresentado aqui. A configuração experimental ilustrada é para as culturas de Chlamydomonas sincronizadas usando 12 h/12 h de luz/condições escuras. As amostras foram coletadas em um ciclo de 24 células h para demonstrar que os metabólitos, lipídios e amido obtidos utilizando várias plataformas analíticas estão bem conformados. Além disso, amostras de proteínas coletadas utilizando o mesmo protocolo de extração foram utilizadas para realizar análises de proteômica detalhadas para avaliar sua qualidade e reprodutibilidade. Com base nos dados, pode-se inferir que o método ilustrado fornece uma abordagem robusta e reprodutível para o avanço da compreensão de várias vias bioquímicas e suas funções com maior confiança para a pesquisa básica e aplicada.
As microalgas são uma fonte rica de produtos naturais (por exemplo, combustíveis, nutrição humana e animal, cosméticos e substâncias farmacológicas). Numerosos esforços de pesquisa são realizados para aumentar a eficiência da produção de produtos de alto valor a partir de microalgas1,2,3,4. A compreensão em nível de sistemas do metabolismo é um pré-requisito para melhorar a qualidade e o rendimento dos produtos naturais5,6,7. Com o advento de técnicas genómicas funcionais e melhores métodos de espectrometria de massas, milhares de genes, transcrições, proteínas e metabólitos podem ser monitorados simultaneamente. No entanto, várias amostras são necessárias para os estudos de proteômica, Shotgun e Metabolômica em profundidade, que muitas vezes é difícil de alcançar em organismos unicelulares, especialmente se os estudos de curso de tempo devem ser realizados. Além disso, a coleta e o processamento de diferentes alíquotas de amostra em combinação com diferentes protocolos para coletar os dados Ômicas altamente complexos (i.e., proteômicos, lipidomicos e metabólicos) introduz variabilidade, tornando assim a integração dos dados um tarefa desafiadora.
Chlamydomonas fornece não só um excelente sistema microbiano para a investigação de processos celulares, mas também um modelo conveniente para estudar a coordenação do ciclo celular e metabolismo. Assim, uma forte coordenação da expressão de transcrições com o ciclo celular tem sido mostrada usando o perfil de transcriptoma de alta resolução da cultura sincronizada de Chlamydomonas8. Cerca de 80% das transcrições analisadas exibiram periodicidade robusta em um ciclo de 24 células h8. Da mesma forma, o peso seco, proteínas, clorofila, aminoácidos e ácidos graxos de duas cepas diferentes de Chlamydomonas mostraram-se correlacionar com a divisão celular em um estudo onde a amostragem foi realizada a cada 4 h9. Recentemente, relatou-se que o metabolito e a dinâmica lipídica do deslocamento celular com base em fases específicas do ciclo celular10. As mudanças sutis em diferentes biomoléculas foram possíveis para monitorar o uso de um robusto éter terc-butilo (MTBE): metanol: método de extração à base de água, que oferece um ponto de partida ideal para uma análise abrangente de vários Omics10 , o 11.
Os guias de protocolo apresentados através de uma estratégia reprodutível e eficiente10, para a extração simultânea de lipídios, metabólitos, proteínas e amido de uma única amostra alíquota, para o tempo resolvido Metabolômica e estudo lipidomicas de culturas de Chlamydomonas crescentes síncronas. Além de ilustrar os dados metabólicos e lipidomicas robustos e reprodutíveis10, aqui, a qualidade das amostras proteômica obtidas da mesma pelota é demonstrada igualmente.
Neste artigo, nós ilustramos um protocolo robusto e altamente aplicável da extração para o lipidomics detalhado, o Metabolomics, o amido e a análise do proteômica de uma única pelota de 10-15 x 106 pilhas. O método foi implementado com sucesso em vários estudos para uma ampla gama de células e tecidos10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Aqui, nós apresentamos um encanamento Stepwise para a análise do multi-Omics de biomoléculas diferentes de uma única amostra colhida da cultura de Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 MT +).
O protocolo fornece uma abordagem robusta e reprodutível para processar várias amostras de uma só vez, para a análise de várias biomoléculas. Entretanto, um número de etapas críticas deve ser tomado cuidado fora a fim minimizar a variação técnica. Em primeiro lugar, a colheita das células deve ser feita o mais rapidamente possível, mantendo as condições uniformes para todas as amostras colhidas para preservar o estado biológico das células. Embora tenhamos usado a centrifugação para colher as células, estratégias de colheita alternativas podem ser utilizadas para a colheita das amostras. No entanto, é importante notar que diferentes estratégias de colheita são conhecidas por influenciar o estado metabólico das células37 portanto, a abordagem de colheita consistente deve ser usada para todas as amostras experimentais. Em segundo lugar, é importante evitar a secagem da fase não polar superior contendo clorofila, uma vez que isso pode influenciar os níveis de clorofila dissolvida no solvente que afetam o fator de normalização para as amostras. Finalmente, o cuidado deve ser tomado ao remover a fase polar restante para obter a pelota da proteína e do amido, para evitar perturbar a pelota que pode influenciar o índice do amido e da proteína.
Assim apresentado protocolo de extração oferece vários benefícios para a análise de dados de múltiplos Omics. Além de minimizar o número de alíquotas de amostra exigidas, também reduz a variação entre os resultados analíticos obtidos para diferentes biomoléculas. Isso permite a comparação direta dos resultados obtidos a partir dos metabólitos primários, lipídios e dados proteônicos. Da mesma forma, a extração simultânea de várias classes compostas permite a estratégia de normalização consistente e uniforme dos diferentes conjuntos de dados. Isto é especialmente aplicável se a normalização é difícil de alcançar usando o peso seco ou fresco38 ou número de célula.
O protocolo pode ser implementado para a triagem rotineira de uma amostra biológica complexa. Estes conjuntos de dados metablomic, lipidomicas e proteômica holísticos podem oferecer a informação detalhada sobre mudanças sistemáticas no metabolismo. Adicionalmente, os dados obtidos a partir da análise proteômica, fornecem insights sobre as alterações quantitativas (abundância) e qualitativas (modificações) nas proteínas em relação aos metabólitos. Assim, a integração de dados Ômicas poderia revelar informações aprofundadas sobre as alterações induzidas por perturbações genéticas ou bióticas e/ou abióticas de um sistema biológico. Assim, elucidar mudanças moleculares de vias metabólicas específicas ou processos celulares. Da mesma forma, esses dados de alta taxa de transferência podem permitir a identificação de alvos para a engenharia metabólica e refinar ou testar previsões de modelos metabólicos de escala de genoma37,39.
The authors have nothing to disclose.
Estamos muito gratos a Gudrun Wolter e Änne Michaelis por uma excelente assistência técnica. Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório Giavalisco por sua ajuda. Somos gratos à sociedade Max Planck por financiar a pesquisa e a FAPESP para a comunhão de L A Giraldi
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |