ניתוח כלל מערכת של biomolecules מרובות הוא חיוני להשגת תובנות פונקציונליות ומכניסטיות לתהליכים ביולוגיים. בזאת, פרוטוקול נרחב מתואר עבור הפקת תפוקה גבוהה של שומנים, מטבוליטים, חלבונים ועמילן ממדגם אחד שנקטפו מן התרבות Chlamydomonas מסונכרן.
מיקרואצות היו המוקד של מחקר עבור היישומים שלהם בייצור של תרכובות ערך גבוה, מזון ודלק. כמו-כן, הם מודלים פוטוסינתטיים יקרי ערך הקוראים להבנת התהליכים הסלולאריים הבסיסיים. מחקרים רחבים מאפשרים הבנה מקיפה ומעמיקה של פונקציות מולקולריות של האורגניזמים. עם זאת, דגימות עצמאיות ופרוטוקולים מרובים נדרשים עבור פרוטמרים, lipidomics ו טבולומיקס מחקרים המציגים שגיאה גבוהה יותר והשתנות. שיטה חזקה הפקת תפוקה גבוהה עבור החילוץ סימולטני של כלורופיל, שומנים, מטבוליטים, חלבונים ועמילן ממדגם אחד של הירוק אצה Chlamydomonas ריינהרט מוצג כאן. ההתקנה הניסיונית מאוירת היא עבור תרבויות Chlamydomonas מסונכרנים באמצעות 12 h/12 h תנאים אור/כהה. דגימות נאספו מעל מחזור תא 24 h כדי להדגים את מטבוליטים, שומנים ונתונים עמילן המתקבלים באמצעות פלטפורמות אנליטיות שונות הם הותאמו היטב. יתר על כן, דגימות חלבונים שנאספו באמצעות אותו פרוטוקול החילוץ שימשו כדי לבצע ניתוח פרוטאומוניקס מפורט כדי להעריך את איכותם ואת התוכסות. בהתבסס על הנתונים, ניתן להסיק כי השיטה מומחש מספקת גישה איתנה ומגובשת להבנת המסלולים הביוכימיים השונים והתפקודים שלהם בעלי ביטחון רב יותר עבור מחקר בסיסי ומיושם.
מיקרואצות הן מקור עשיר למוצרים טבעיים (לדוגמה, דלקים, תזונה אנושית ובעלי חיים, תמרוקים וחומרים פרמקולוגיים). מאמצי מחקר רבים מתבצעים כדי לשפר את יעילות הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה ממיקרואצות1,2,3,4. מערכות ברמת הבנה של חילוף החומרים הוא הכרחי כדי לשפר את איכות ותשואה של מוצרים טבעיים5,6,7. עם הופעתו של טכניקות גנומית תפקודית ושיטות משופרות ספקטרומטר המסה, אלפי גנים, תעתיקים, חלבונים, מטבוליטים ניתן לפקח בו זמנית. עם זאת, מספר רב של דגימות נדרשות עבור פרוטאומיקס מעמיק, lipidomics ו טבולומיקס מחקרים, אשר לעתים קרובות קשה להשיג אורגניזמים חד-תאיים, במיוחד אם מחקרים בזמן הקורס הם להתבצע. יתר על כן, איסוף ועיבוד של מדגם שונה מדגימה בשילוב עם פרוטוקולים שונים כדי לאסוף את הנתונים מורכבים מאוד omics (כלומר, פרוטאומומית, lipidomic, ו טבולומיקס) מציג את השונות, ובכך עושה שילוב של נתונים משימה מאתגרת.
Chlamydomonas מספק לא רק מערכת חיידקים מעולה לחקירת תהליכים סלולריים, אלא גם מודל נוח ללמוד את הקואורדינציה של מחזור התא וחילוף החומרים. לפיכך, תיאום חזק של ביטוי התעתיקים עם מחזור התא הוכח באמצעות ברזולוציה גבוהה ההמרה פרופיל של תרבות מסונכרנת של Chlamydomonas8. כ 80% של התעתיקים שנותחו הציגו חזק תקופתיות על מחזור תא 24 h8. כמו כן, יבש משקל, חלבונים, כלורופיל, חומצות אמינו וחומצות שומן של שני זנים שונים של Chlamydomonas הוכחו לתאם עם חלוקת התא במחקר שבו הדגימה בוצעה כל 4 h9. לאחרונה, דווח כי הדינמיקה המטטבוליט והשומנים של המשמרת התא מבוסס על שלבים ספציפיים של מחזור התא10. השינויים העדינים בbiomolecules שונים היו ניתנים לניטור באמצעות אתר מתילבוטיל חזק (mtbe): מתנול: מבוסס מים שיטת החילוץ, אשר מציעה נקודת התחלה אידיאלית עבור ניתוח multi-omics מקיפה10 , . בסדר, 11
הפרוטוקול המוצג מדריכים באמצעות אסטרטגיה מקבילה ויעילה10, עבור החילוץ בו של שומנים, מטבוליטים, חלבונים ועמילן מתוך מדגם יחיד aliquot, עבור הזמן נפתרה metabolomic ו lipidomic המחקר של תרבויות Chlamydomonas הגדלות בצורה סינכרונית. בנוסף הממחישות את הנתונים החזקים והמטבוליים מטבולית ו lipidomic10, כאן, את האיכות של דגימות פרוטאומית שהתקבלו מן הגלולה אותו הוא גם הפגינו.
במאמר זה, אנו מאוירים פרוטוקול החילוץ חזקה וישימה מאוד עבור lipidomics מקיפה, טבולומיקס, עמילן וניתוח פרוטאומניקס מתוך גלולה אחת של 10-15 x 106 תאים. השיטה יושמה בהצלחה במספר מחקרים למגוון רחב של תאים ורקמות10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. כאן, הצגנו קו הצינור לאבחון מולטי-omics של biomolecules שונים ממדגם אחד שנקטפו Chlamydomonas ריינהרט (CC-1690 mt +) תרבות.
הפרוטוקול מספק גישה איתנה ומגובשת לעיבוד דגימות מרובות בבת אחת, לניתוח biomolecules שונות. עם זאת, יש לטפל במספר שלבים קריטיים כדי למזער את הווריאציה הטכנית. ראשית, קצירת התאים צריך להיעשות במהירות האפשרית תוך שמירה על התנאים אחיד עבור כל הדגימות שנקטפו כדי לשמר את המצב הביולוגי של התאים. למרות שנהגנו צנטריפוגה לקצור את התאים, אסטרטגיות קציר חלופי ניתן להשתמש לקצירת דגימות. עם זאת, חשוב לציין כי אסטרטגיות קציר שונות ידועים להשפיע על מצב חילוף החומרים של התאים37 ולכן, הגישה הקציר עקבית חייב לשמש עבור כל הדגימות ניסיוני. שנית, חשוב להימנע מייבוש של השלב העליון שאינו קוטבי המכיל כלורופיל, מאז זה יכול להשפיע על רמות של כלורופיל מומס הממס המשפיעים על פקטור הנורמליזציה עבור הדגימות. לבסוף, הטיפול צריך להילקח תוך הסרת שלב הקוטב הנותרים כדי להשיג את החלבון ואת הגלולה עמילן, כדי למנוע מפריע את הגלולה אשר יכול להשפיע על העמילן ואת תכולת החלבון.
ובכך הציג פרוטוקול החילוץ מציע מספר יתרונות עבור ניתוח נתונים מרובים-omics. מלבד למזער את מספר המדגם הנדרש, זה גם מפחית את הווריאציה בין התוצאות האנליטיות שהתקבלו עבור biomolecules שונים. זה מאפשר השוואה ישירה של התוצאות המתקבלות מטבוליטים העיקריים, שומנים ונתונים פרוטאומית. באופן דומה, ההוצאה הזמנית של מחלקות מורכבות מרובות מאפשרת אסטרטגיית נורמליזציה עקבית ואחידה של ערכות נתונים שונות. הדבר ישים במיוחד אם הנורמליזציה קשה להשגה באמצעות משקל יבש או טרי38 או מספר תאים.
ניתן ליישם את הפרוטוקול להקרנה שגרתית של דגימה ביולוגית מורכבת. אלה metabolomic הוליסטית, ערכות מידע lipidomic ו פרוטאומית יכול להציע מידע מקיף על שינויים שיטתית בחילוף החומרים. בנוסף, את הנתונים שהתקבלו מניתוח פרוטאומניקס, מספק תובנות לגבי כמותי (שפע) ואיכותי (שינויים) שינויים בחלבונים ביחס מטבוליטים. מכאן, שילוב נתונים omics יכול לחשוף מידע מעמיק על שינויים הנגרמת על ידי גנטי או ביוטי ו/או אביוטיים רטבאליות של מערכת ביולוגית. לפיכך, להבהיר שינויים מולקולריים של מסלולים מטבוליים ספציפיים או תהליכים סלולריים. באופן דומה, אלה נתונים תפוקה גבוהה יכול לאפשר זיהוי של מטרות עבור הנדסת חילוף החומרים ולחדד או לבדוק תחזיות מודלים מטבולית בקנה מידה של הגנום37,39.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים מאוד לגורון וולטר ולאנטה מיכיין לקבלת סיוע טכני מעולה. היינו רוצים להודות לכל חברי מעבדת Giavalisco על עזרתם. אנו מודים לחברת מקס פלאנק למימון המחקר ו-FAPESP עבור האחווה של L ‘ גירלדי
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |