Estudo de toxicidade de nanopartículas de óxido de zinco em cultura celular e em Drosophila melanogaster
Summary
Nós descrevemos um protocolo detalhado para avaliar os perfis toxicológicos de nanopartículas do óxido de zinco (ZnO NPs) no detalhe, o tipo de morte da pilha em fibroblastos humanos do pulmão MRC5 e na formação dos ROS na mosca da fruta Drosophila.
Abstract
As nanopartículas de óxido de zinco (ZnO NPs) têm uma ampla gama de aplicações, mas o número de relatos sobre a toxicidade associada ao ZnO NP cresceu rapidamente nos últimos anos. No entanto, estudos que elucidar os mecanismos subjacentes para a toxicidade induzida por ZnO NP são escassos. Nós determinamos os perfis da toxicidade de ZnO NPs usando modelos in vitro e in vivo experimentais. Uma diminuição significativa na viabilidade celular foi observada em fibroblastos pulmonares MRC5 expostos ao ZnO NP, mostrando que os NPs ZnO exercem efeitos citotóxicos. Da mesma forma, curiosamente, o intestino exposto a ZnO NPs exibiu um aumento dramático nos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) na mosca da fruta Drosophila. São necessários estudos mais aprofundados para estabelecer uma avaliação de risco para o aumento da utilização de ZnO NPs pelos consumidores.
Introduction
A nanotecnologia refere-se à aplicação de materiais nanodimensionados que são utilizados em todos os campos científicos, incluindo medicina, ciência dos materiais e bioquímica. Por exemplo, ZnO NPs que são conhecidos por sua dispersão ultravioleta, sensoriamento químico, e propriedades antimicrobianas, bem como alta condutividade elétrica, são utilizados na produção de vários produtos de consumo, tais como embalagens de alimentos, cosméticos, têxteis, borrachas, baterias, catalisador para o tratamento de gás de cauda de automóvel, e aplicações biomédicas1,2,3.
No entanto, as aplicações crescentes de produtos baseados em ZnO NP, que levam ao aumento da exposição humana ao ZnO NPs, suscitou preocupações sobre os seus potenciais efeitos adversos na saúde humana. Vários estudos celulares in vitro demonstraram que ZnO NPS pode induzir estresse oxidativo, citotoxicidade relacionada à autofagia, inflamação e genotoxicidade4,5,6,7,8 . Notavelmente, presume-se que a toxicidade de ZnO NPs é causada pela dissolução de Zn para liberar Zn2 + íons, bem como a reatividade superficial de ZnO, resultando em desequilíbrios celulares iônicos e metabólicos que estão ligados com a homeostase iônica prejudicada e um inibição do transporte iônico4,7,9,10. É importante ressaltar que estudos demonstraram que a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) é um dos mecanismos primários subjacentes à toxicidade associada à ZnO NPs. A atividade antioxidativa insuficiente que segue o insulto de ROS foi mostrada para ser responsável para provocar a citotoxicidade e dano do ADN9. Os efeitos tóxicos de ZnO NPS também foram relatados em modelos animais, incluindo roedor1, zebrafish11,12, bem como a Drosophilade invertebrados13.
A Drosophila serve como um modelo animal alternativo bem estabelecido para a triagem de toxicidade de entidades químicas e nanomateriais (NMS)14,15. É importante ressaltar que existem altos níveis de similaridade genética e fisiológica entre o ser humano e a Drosophila que justifica o uso da Drosophila como um modelo in vivo para avaliar respostas biológicas a contaminantes ambientais, como NMS 16. Além disso, existem muitas vantagens de usar a Drosophila devido ao seu tamanho pequeno, tempo curto, Amenability genético, e fácil e custo-benefício de manutenção. Além disso, a Drosophila tem sido amplamente adotada para o estudo da genética, biologia molecular e do desenvolvimento, desde que seu genoma completo foi totalmente seqüenciado anos atrás em 2000, tornando-o adequado para uma variedade de triagem de alta taxa de transferência e para abordar questões biológicas não resolvidas17,18,19,20,21. Nos últimos anos, vários estudos relacionados à imunotoxicidade utilizando diferentes tipos de NPS na Drosophila foram relatados15,22,23,24. Este novo conhecimento fundamental obtido a partir dos estudos que utilizam a Drosophila tem ajudado a fornecer mais insights sobre a nossa compreensão da nanotoxicologia.
ROS é um bem conhecido culpado de citotoxicidade e genotoxicidade causada por NPs, em particular, NPs baseados em metal25. ROS são espécies químicas contendo oxigênio com propriedades reativas mais elevadas do que o oxigênio molecular. Os radicais livres tais como o radical do superóxido (O2–) e mesmo, moléculas não-radicais tais como o peróxido de hidrogênio (H2O2) podem actuar como Ros. condições fisiológicas normais, eles são obrigados a manter a homeostase celular26, no entanto, Ros excessivos devido à superprodução ou desregulação do sistema de defesa antioxidante pode causar estresse oxidativo, levando a danos às proteínas, lipídios e Ácido desoxirribonucleico (DNA)27. Por exemplo, à medida que os níveis de ROS aumentam e o nível de glutationa (GSH) diminui concomitantemente, a ruptura da síntese de trifosfato de adenosina (ATP) ocorre e o nível de lactato desidrogenase (LDH) aumenta no meio, culminando na morte celular27.
Aqui, nós fornecemos protocolos para a realização de análises celulares e genéticas usando células de mamíferos cultivadas e Drosophila para determinar os potenciais efeitos adversos de ZnO NPS. Uma visão geral do método utilizado para o estudo de toxicidade de ZnO NPs é mostrada na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
A fim avaliar se ZnO NP pode induzir o apoptose em fibroblastos MRC5, nós usamos o fluxo citometria para distinguir as pilhas da morte Necrotic ou apoptóticas da pilha. Em células normais ao vivo, a fosfatidilserina (PS) é localizada na membrana celular. Se a apoptose ocorre, o PS é translocalizado para o folheto extracelular da membrana plasmática, permitindo a ligação da anexina V rotulada com fluoresceina (FITC anexina V)29. De um lado, o iodeto vermelho-fluorescente do propidium (PI), …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O estudo foi apoiado pelo número de subvenção R706-000-043-490. O estudo não representa a visão do patrocinador da subvenção.
Materials
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Image J software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
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