Estudio de toxicidad de nanopartículas de óxido de zinc en el cultivo celular y en Drosophila melanogaster
Summary
Describimos un protocolo detallado para evaluar los perfiles toxicológicos de nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP) en particular, el tipo de muerte celular en fibroblastos pulmonares MRC5 humanos y la formación de ROS en la mosca de la fruta Drosophila.
Abstract
Las nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP) tienen una amplia gama de aplicaciones, pero el número de informes sobre la toxicidad asociada a ZnO NP ha crecido rápidamente en los últimos años. Sin embargo, los estudios que aclaran los mecanismos subyacentes para la toxicidad inducida por ZnO NP son escasos. Determinamos los perfiles de toxicidad de los NP de ZnO utilizando modelos experimentales in vitro e in vivo. Se observó una disminución significativa en la viabilidad celular en los fibroblastos pulmonares MRC5 expuestos a ZnO NP, lo que muestra que los NP de ZnO ejercen efectos citotóxicos. Del mismo modo, curiosamente, el intestino expuesto a los NP de ZnO exhibió un aumento dramático en los niveles reactivos de las especies de oxígeno (ROS) en la mosca de la fruta Drosophila. Se requieren estudios más detallados para establecer una evaluación del riesgo para el aumento del uso de LOS NP de ZnO por parte de los consumidores.
Introduction
La nanotecnología se refiere a la aplicación de materiales de tamaño nanométrico que se utilizan en todos los campos científicos, incluyendo la medicina, la ciencia de los materiales y la bioquímica. Por ejemplo, los NP ZnO que son conocidos por su dispersión ultravioleta, detección química y propiedades antimicrobianas, así como alta conductividad eléctrica, se utilizan en la producción de diversos productos de consumo como envases de alimentos, cosméticos, textiles, cauchos, baterías, catalizadores para el tratamiento de gas de cola de automóviles, y aplicaciones biomédicas1,2,3.
Sin embargo, las crecientes aplicaciones de los productos basados en ZnO NP, que conducen a una mayor exposición humana a los NP de ZnO, han suscitado preocupaciones sobre sus posibles efectos adversos sobre la salud humana. Varios estudios celulares in vitro han demostrado que los NP de ZnO pueden inducir estrés oxidativo, citotoxicidad relacionada con la autofagia, inflamación y genotoxicidad4,5,6,7,8 . En particular, se supone que la toxicidad de znO NP es causada por la disolución de Zn para liberar iones Zn2+, así como la reactividad superficial de ZnO, lo que resulta en los desequilibrios iónicos y metabólicos celulares que están relacionados con la homeostasis iónica deteriorada y una inhibición del transporte iónico4,7,9,10. Es importante destacar que los estudios han demostrado que la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) es uno de los principales mecanismos subyacentes a la toxicidad asociada a los NP de ZnO. Se ha demostrado que la insuficiente actividad antioxidante después del insulto ROS es responsable de provocar la citotoxicidad y el daño al ADN9. Los efectos tóxicos de znO NP también se han divulgado en modelos animales, incluyendo roedores1, pez cebra11,12, así como el invertebrado Drosophila13.
Drosophila sirve como un modelo animal alternativo bien establecido para el cribado de toxicidad de entidades químicas y nanomateriales (NMs)14,15. Es importante destacar que existen altos niveles de similitud genética y fisiológica entre el ser humano y Drosophila que justifican el uso de Drosophila como modelo in vivo para evaluar las respuestas biológicas a contaminantes ambientales como los NM 16. Además, hay muchas ventajas de usar Drosophila debido a su pequeño tamaño, corta vida útil, amenabilidad genética y mantenimiento fácil y rentable. Además, Drosophila ha sido ampliamente adoptada para el estudio de la genética, la biología molecular y del desarrollo, desde que su genoma completo fue completamente secuenciado hace años en 2000, por lo que es adecuado para una variedad de cribado de alto rendimiento y para abordar las cuestiones biológicas no resueltas17,18,19,20,21. En los últimos años, se han notificado varios estudios relacionados con la inmunotoxicidad utilizando diferentes tipos de NP en Drosophila 15,22,23,24. Este nuevo conocimiento fundamental obtenido de los estudios con Drosophila ha ayudado a proporcionar más información sobre nuestra comprensión de la nanotoxicología.
ROS es un conocido culpable de citotoxicidad y genotoxicidad causada por los NP, en particular, los NP a base de metal25. ROS son especies químicas que contienen oxígeno con propiedades reactivas más altas que el oxígeno molecular. Los radicales libres como el radical superóxido (O2–) e incluso, moléculas no radicales como el peróxido de hidrógeno (H2O2) pueden actuar como ROS. Bajo condición fisiológica normal, se requieren para mantener la homeostasis celular26,sin embargo, ROS excesiva debido a la sobreproducción o desregulación del sistema de defensa antioxidante puede causar estrés oxidativo, lo que conduce a daños a las proteínas, lípidos y ácido desoxirribonucleico (ADN)27. Por ejemplo, a medida que los niveles de ROS aumentan y el nivel de glutatión (GSH) disminuye de forma concomitante, se produce la interrupción de la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) y el nivel de lactato deshidrogenasa (LDH) aumenta en el medio, culminando en la muerte celular27.
Aquí, proporcionamos protocolos para realizar análisis celulares y genéticos utilizando células de mamíferos cultivadas y Drosophila para determinar los posibles efectos adversos de los NP de ZnO. En la Figura 1se muestra una descripción general del método utilizado para el estudio de toxicidad de los NP de ZnO.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con el fin de evaluar si ZnO NP puede inducir apoptosis en fibroblastos MRC5, utilizamos citometría de flujo para distinguir las células de la muerte de células necróticas o apoptoticas. En las células vivas normales, la fosfatidilserina (PS) se localiza en la membrana celular. Si se produce apoptosis, PS se traslada al prospecto extracelular de la membrana plasmática, lo que permite la unión de Annexin V etiquetado con fluoresceína (FITC Annexin V)29. Por otro lado, el yoduro de propidium…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado por el número de subvención R706-000-043-490. El estudio no representa la opinión del patrocinador de la subvención.
Materials
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Image J software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
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