מחקר רעילות של תחמוצת אבץ חלקיקים בתרבות התא ו- Drosophila ילה מלאנוסטר
Summary
אנו מתארים פרוטוקול מפורט להערכת פרופילי הרעילות של חלקיקי תחמוצת אבץ (ZnO NPs) בפרט, סוג של מוות התאים בMRC5 ריאות האדם היווצרות ו רוס המבנה של הפרי זבוב Drosophila ילה.
Abstract
תחמוצת אבץ חלקיקי (ZnO NPs) יש מגוון רחב של יישומים, אבל מספר דוחות על רעילות ZnO NP-הקשורים גדל במהירות בשנים האחרונות. עם זאת, מחקרים שבהסבר המנגנון הבסיסי לרעילות ZnO NP המושרה הם scanty. קבענו את פרופילי הרעילות של ZnO NPs באמצעות שניהם בתוך מבחנה במודלים ניסיוני vivo. ירידה משמעותית בכדאיות התאים נצפתה ב-ZnO NP-חשופים MRC5 ריאות פיברותקיעות, מראה כי אין NPs להפעיל אפקטים ציטוטוקסיים. באופן דומה, מעניין, המעיים חשופים ל-ZnO NPs הציגו עלייה דרמטית ברמות מינים של חמצן תגובתי (ROS) בזבוב הפירות דרוזוהילה. מחקרים מעמיקים יותר נדרשים כדי ליצור הערכת סיכונים עבור השימוש המוגבר של NPs ZnO על ידי הצרכנים.
Introduction
ננוטכנולוגיה מתייחסת ליישום של חומרים ננו הנמצאים בשימוש בכל התחומים המדעיים, כולל רפואה, מדעי החומרים, וביוכימיה. לדוגמה, החומרים הידועים לפיזור האולטרה סגול, החישה הכימית ותכונות האנטי-מיקרוביאלית, כמו גם מוליכות חשמלית גבוהה, מנוצלים בייצור מוצרי צריכה שונים כגון אריזות מזון, קוסמטיקה, טקסטיל, גומי, סוללות, זרז לטיפול בגז זנב מכוניות, ויישומים הקשורים בביו-רפואית1,2,3.
עם זאת, היישומים המתפתחת של מוצרים מבוססי ZnO NP, המוביל חשיפה אנושית מוגברת ל-ZnO NPs, העלו חששות על תופעות לוואי פוטנציאליות שלהם על בריאות האדם. מספר מחקרים סלולריים מחוץ לתחום הוכיחו כי הNPs zno יכול לגרום ללחץ חמצוני, מכשירים אוטומטיים הקשורים ציטורעילות, דלקת, ו-גנוגיה4,5,6,7,8 . בעיקר, רעילות של הארגון zno היא נגרמת על ידי פירוק של zno כדי לשחרר zno2 + יונים, כמו גם את הפעילות מחדש של zno, וכתוצאה מכך יוני הסלולר וחוסר איזון מטבולי המקושרים עם לקויי הומאוסטזיס היוניים ו עיכוב של הובלת יונים4,7,9,10. חשוב מאוד, מחקרים הראו כי הדור של מיני חמצן תגובתי (ROS) הוא אחד המנגנונים העיקריים המשמשים הרעילות ZnO הקשורים NPs. מספיק נגד חמצון פעילות לאחר העלבון ROS הוכח להיות אחראי על הגורם הרעילות הציטוזה נזק DNA9. ההשפעות הרעילות של הNPs של זאין יש גם דווחו בדגמי בעלי חיים, כולל מכרסם1, zbrafish11,12, כמו גם את חסרי חוליות drosophila ילה13.
Drosophila ילה משמש מודל מבוסס בעלי חיים חלופיים עבור הקרנת רעילות של ישויות כימיות וננו (nms)14,15. וחשוב מכך, ישנן רמות גבוהות של דמיון גנטי ופיזיולוגי בין בני אדם לדרוסופילה המצדיק את השימוש בדרוסופילה כמודל vivo להערכת תגובות ביולוגיות למזהמים סביבתיים כגון nms 16. יתר על כן, ישנם יתרונות רבים של שימוש Drosophila ילה בשל גודלו הקטן, תוחלת חיים קצרה, האיומים הגנטיים, ותחזוקה קלה וחסכונית. יתר על כן, Drosophila ילה אומצה באופן נרחב לחקר הגנטיקה, מולקולרית והתפתחותית ביולוגיה, מאז הגנום המלא שלה היה מלא רצף לפני שנים בחזרה 2000, ולכן הופך אותו מתאים עבור מגוון של הקרנת תפוקה גבוהה ולהתמודדות עם שאלות ביולוגיות לא פתורות17,18,19,20,21. בשנים האחרונות, מספר מחקרים הקשורים לאימונוטוקסיקולוגיה באמצעות סוגים שונים של NPs בדרוזוהילה דווחו15,22,23,24. הידע הבסיסי הזה שהתקבל ממחקרים שנעשו באמצעות דרוזופילה עזר לספק תובנות נוספות להבנת הננו-טוקסיקולוגיה.
ROS הוא העבריין הידוע עבור הרעלת ציטוזה ורעילות הנגרמת על ידי NPs, בפרט, בסיס מתכת מבוסס NPs25. רוס הם מינים כימיים המכילים חמצן עם תכונות תגובתי גבוהה יותר מאשר חמצן מולקולרי. רדיקלים חופשיים כגון סופראוקסיד רדיקלים (O2–) ואפילו, מולקולות שאינן קיצוניות כגון מי חמצן (H2o2) יכול לשמש ROS. תחת המצב הפיזיולוגי הרגיל, הם נדרשים לשמור על הומאוסטזיס הסלולר26, עם זאת, מוגזם ROS בשל הפקת יתר או דיסרגולציה של מערכת ההגנה נוגד חמצון יכול לגרום ללחץ חמצוני, המוביל נזק לחלבונים, שומנים וחומצה deאוקסיריוונקלאית (DNA)27. למשל, כמו העלייה ברמות של רוס ו גלוטתיון (gsh) הרמה פוחתת במקביל, שיבוש אדנוזין טריפוספט (ATP) סינתזה מתרחש ו לקטט דהידרוגנאז (ldh) רמת מגדילה בינונית, ששיאה במוות התאים27.
כאן, אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע ניתוחים סלולריים וגנטיים תוך שימוש בתאי יונקים מתורבתים ודרוזוהילה כדי לקבוע את ההשפעות השליליות הפוטנציאליות של אי-הצורך בNPs. מבט כולל על השיטה המשמשת לחקר רעילות של ZnO NPs מוצג באיור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
על מנת להעריך אם ZnO NP יכול לגרום אפופטוזיס ב MRC5 פיברותקיעות, אנו משתמשים בזרם cy, לנסות להבדיל בין התאים נמק או מוות של תאים האפוטוטיים. בתאים חיים רגילים, פוספולידיסרין (PS) מותאם לשפה הקרום של התא. אם ואפופטוזיס מתרחשת, PS הוא translocated מוקם לתוך העלון של קרום הפלזמה, המאפשר את הכריכה של אנשין V מת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר היה נתמך על ידי מספר מענק R706-000-043-490. המחקר אינו מייצג את ההשקפה של נותן החסות המענק.
Materials
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Image J software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
References
- Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
- Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
- Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
- De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
- Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
- Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
- Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
- Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
- Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
- Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
- Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
- Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
- Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
- Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
- Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
- Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
- Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster – a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
- Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
- Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
- Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
- Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
- Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
- Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).
- Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
- Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).
