Künstliche RNA-Polymerase II-Dehnungskomplexe zur Sezieren von co-transkriptionellen RNA-Verarbeitungsereignissen
Summary
Hier beschreiben wir die Montage von RNA-Polymerase II (Pol II) Dehnungskomplexen, die nur kurze synthetische DNA- und RNA-Oligonukleotide und gereinigte Pol II erfordern. Diese Komplexe sind nützlich für die Untersuchung von Mechanismen, die der kotranskriptiellen Verarbeitung von Transkripten im Zusammenhang mit dem Pol-II-Dehnungskomplex zugrunde liegen.
Abstract
Die eukaryotische mRNA-Synthese ist ein komplexer biochemischer Prozess, der die Transkription einer DNA-Vorlage in eine Vorläufer-RNA durch das Multi-Subunit-Enzym RNA-Polymerase II und die kotranskriptionale Verkabelung und Spleißung der Vorläufer-RNA zur Bildung der reifen mRNA erfordert. Während der mRNA-Synthese ist der RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplex ein Ziel für die Regulierung durch eine große Sammlung von Transkriptionsfaktoren, die seine katalytische Aktivität steuern, sowie die Verschluss-, Spleiß- und 3′-Verarbeitungsenzyme, die die ausgereifte mRNA erzeugen. Aufgrund der inhärenten Komplexität der mRNA-Synthese haben einfachere experimentelle Systeme, die die Isolierung und Untersuchung ihrer verschiedenen kotranskriptionsbasierten Stadien ermöglichen, einen großen Nutzen.
In diesem Artikel beschreiben wir ein solches einfaches experimentelles System, das für die Untersuchung der co-transkriptionellen RNA-Verkappung geeignet ist. Dieses System stützt sich auf definierte RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe, die aus gereinigten Polymerase- und künstlichen Transkriptionsblasen zusammengesetzt sind. Bei immobilisierter DNA-Deaktivierung bieten diese RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe ein leicht zu manipulierbares Werkzeug zur Sezieren von co-transkriptioniellen RNA-Verschließungen und Mechanismen, mit denen der Dehnungskomplex das Verschlussenzym während der co-transkriptionelle RNA-Verkappung. Wir gehen davon aus, dass dieses System für die Untersuchung der Rekrutierung und/oder Montage von Proteinen oder Proteinkomplexen mit Rollen in anderen Stadien der mRNA-Reifung angepasst werden könnte, die an den Dehnungskomplex der RNA-Polymerase II gekoppelt sind.
Introduction
Die eukaryotische Boten-RNA-Synthese (mRNA) ist ein ausgeklügelter biochemischer Prozess, der die Synthese einer unverarbeiteten Vorläufer-RNA durch RNA-Polymerase II und die Verarbeitung der Vorläufer-RNA umfasst, um die ausgereifte mRNA zu erhalten. Die RNA-Verarbeitungsschritte der Verkappung, Spleißung und Polyadenylierung werden weitgehend ko-transkriptional durchgeführt. Der Dehnungskomplex Pol II dient als Gerüst, das die Aktivitäten vieler RNA-Verarbeitungsenzyme rekrutiert und orchestriert. Folglich wird unser endgültiges Verständnis, wie ausgereifte eukaryotische mRNAs erzeugt werden, in hohem Maße von der Entwicklung experimenteller Systeme abhängen, um die Zerlegung der biochemischen Mechanismen, die der Rekrutierung zugrunde liegen, an den Dehnungskomplex und Regulierung von Enzymen, die für die kotranskriptionelle Verkappung, Spleißung und Polyadenylierung verantwortlich sind.
Es überrascht nicht, dass die Entwicklung solcher experimentellen Systeme schwierig war. Ein großes Hindernis war die bemerkenswerte Komplexität der Pol-II-Transkription selbst, bei der die einfache Rekonstituierung der Basaltranskription durch Pol II in vitro einen Mindestsatz von fünf allgemeinen Transkriptionsinitiationsfaktoren erfordert: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF und TFIIH 1. Darüber hinaus erfordert die Wiederherstellung jeglicher Art von regulierter Pol-II-Transkription in vitro einen noch größeren Satz von Transkriptionsfaktoren und Koregulierungen. Ein wichtiges Ziel war es daher, einfachere experimentelle Systeme zu entwickeln, die die Rekonstitution aktiver Pol-II-Dehnungskomplexe ermöglichen, die für Untersuchungen der funktionellen Kopplung von Pol II Transkription und RNA-Verarbeitung geeignet sind.
Eine derart einfachere Methode zur Rekonstituierung aktiver Pol-II-Dehnungskomplexe hat sich für strukturelle und biochemische Studien zur Dehnung von Pol II und in jüngerer Zeit für die Untersuchung der kotranskriptionellen RNA-Verarbeitung als nützlich erwiesen2,3 ,4,5. In diesem Artikel zeigen wir, wie Pol II Dehnungskomplexe, die aus gereinigten Pol II und synthetischen Transkriptionsblasen hergestellt wurden, effektiv genutzt werden können, um die Mechanismen zu untersuchen, die der kotranskriptionsbasierten Deckelung von aufkeimenden Pol II-Transkripten zugrunde liegen.
Die Deckelung bezieht sich auf die kovalente Zugabe einer 5′-Guanosin-“Kappe” zum 5′-Triphosphat-Ende der entstehenden Pol-II-Transkripte. Die Kappe ist wichtig für nachfolgende Schritte der mRNA Reifung, Transport, Translation und andere Prozesse6,7. Die Kappe wird von einem Enzym, das als Verschlussenzym bezeichnet wird, kotranskriptional zu Pol II-Transkripten hinzugefügt. In Säugetierzellen sind aktive Stellen, die für die RNA 5′-Triphosphatase und guanylyl transferase Aktivitäten des Verschlussenzyms verantwortlich sind, in einem einzigen Polypeptid8enthalten. Das Verschlussenzym wird durch Wechselwirkungen mit noch zu definierten Oberflächen auf dem Pol II-Körper und der Rpb1-Carboxy-Terminal-Domäne (CTD) phosphoryliert auf Ser5 seiner Heptapeptid-Wiederholungen5an den Pol-II-Dehnungskomplex rekrutiert. Im Dehnungskomplex katalysiert das Verschlussenzym die Zugabe einer 5′-Guanosin-Kappe, sobald das entstehende Transkript eine Länge von mindestens 18 Nukleotiden erreicht und aus dem Polymerase-RNA-Ausgangskanal hervorgegangen ist. Im ersten Schritt der Verschlussreaktion hydrolysiert die Triphosphatase die RNA 5′-Triphosphat zu einem 5′-Diphosphat. Im zweiten Schritt wird GTP durch die Guanylyltransferase zu GMP hydrolysiert und bildet ein GMP-Verschlussenzym-Zwischenprodukt. Schließlich überträgt die guanylyl transferase GMP an das 5′-Diphosphat-Ende des entstehenden Transkripts, um die Obergrenze zu erzeugen.
Ein bemerkenswertes Merkmal der Verschlussreaktion ist, dass die kotranskriptionsbezogene Deckelung (d.h. die Deckelung von Transkripten im Zusammenhang mit funktionellen Pol II Dehnungskomplexen) viel effizienter ist als die Deckelung der freien RNA5,9. Eine wichtige Frage auf diesem Gebiet war daher, wie diese dramatische Aktivierung der Deckelung durch Wechselwirkungen des Verschlussenzyms mit dem Pol-II-Dehnungskomplex erreicht wird. In diesem Protokoll beschreiben wir die Montage aktiver RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe unter Verwendung nur gereinigter RNA-Polymerase II und künstlicher Transkriptionsblasen. Diese Methoden ermöglichen die Erstellung von RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexen mit Transkripten definierter Länge und Sequenz. In einer aktuellen Studie haben wir diese definierten RNA-Polymerase-II-Dehnungskomplexe als Modell zur Untersuchung von Aspekten der Mechanismen der RNA-Verkappung5verwendet. Insbesondere zeigten wir, dass (i) die Verkappung von RNA im Zusammenhang mit diesen Dehnungskomplexen mehr als 100-fach effizienter war als die Deckelung freier RNA und (ii) durch TFIIH-abhängige Phosphorylierung der Pol II CTD stimuliert wurde. Der hier beschriebene Ansatz könnte grundsätzlich angepasst werden, um Substrate für die Untersuchung anderer kotranskriptionaler RNA-Verarbeitungsreaktionen im Zusammenhang mit dem Pol-II-Dehnungskomplex zu erzeugen.
In Abschnitt 1 dieses Protokolls entstehen künstliche Dehnungskomplexe, indem ein synthetisches Schablonen-DNA-Oligonukleotid zu einem RNA-Oligonukleotid glüht, das sich an seinem 3′-Ende zu etwa 9 Nukleotiden der Schablonenstrang-DNA ergänzt. Pol II wird dann auf das DNA:RNA-Duplex geladen. Der Dehnungskomplex wird dann durch Zugabe eines teilweise komplementären, nicht-schablonenfreien DNA-Oligonukleotids ergänzt, das an seinem 3′-Ende mit Biotin beschriftet ist (Abbildung 1 und Abbildung 2A). Das RNA-Oligonukleotid wird durch Pol II in diesen Dehnungskomplexen erweitert, um radioaktiv markierte Transkripte von definierter Länge und Sequenz nach Zugabe geeigneter Kombinationen von radioaktiv markierten Nukleotiden zu erstellen. Darüber hinaus kann man mit einer Kombination von Wässen, um nicht inkorporierte Nukleotide zu entfernen und die weitere Zugabe verschiedener Kombinationen von Nukleotiden, Pol II zu verschiedenen Positionen entlang der DNA-Vorlage “laufen” und RNA von definierten Längen synthetisieren. RNA wird dann gereinigt und in denaturierenden Harnstoff-PAGE-Gelen einer Elektrophorese unterzogen. In Abschnitt 2 des Protokolls werden künstliche Dehnungskomplexe verwendet, um die kotranskriptionelle RNA-Verkappung zu analysieren. Das vorgestellte Beispiel misst die Wirkung der TFIIH-abhängigen Phosphorylierung der Pol II CTD auf die co-transkriptionelle RNA-Verkappung. In diesem Experiment messen wir das Ausmaß der Co-Transkriptionsverkappung in Abhängigkeit von der Verschluss-Enzymkonzentration (5, 15 und 45 ng pro Reaktion) und der Zeit (1, 2 und 4 min).
Protocol
Representative Results
Discussion
Studien, die Ereignisse, die mit dem Pol II-Dehnungskomplex gekoppelt sind, wie die RNA-Verarbeitung und die Regulation der Transkriptdehnung selbst, sezieren sollen, können durch den Einsatz eines hochgereinigten Enzymsystems erheblich erleichtert werden. Der Aufbau solcher Enzymsysteme kann eine Herausforderung sein. Die durch den Veranstalter abhängige Transkription durch Pol II erfordert mindestens fünf allgemeine Transkriptionsfaktoren. Die Vorbereitung und Lagerung dieser Faktoren kann Monate dauern; Daher ist d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken S. Shuman für die Bereitstellung des Säugetier-Verschlussenzyms cDNA. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Stipendium des Helen Nelson Medical Research Fund der Greater Kansas City Community Foundation an das Stowers Institute for Medical Research unterstützt. Originaldaten, die diesem Manuskript zugrunde liegen, können über das Stowers Original Data Repository unter http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 abgerufen werden.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
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